[發明專利]一種近紅外熒光生物傳感器的構建方法和檢測方法

有效

• 申請號: 202010059675.9
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111175266B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 任磊;王佳威;李丹陽
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.一種近紅外熒光生物傳感器的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)制備UCNPs，具體方法為：將0.5mmol的YCl₃·6H₂O、YbCl₃·6H₂O與TmCl₃·6H₂O混合物加入1～5mL油酸和5～10mL 1-十八烯中，在50～100mL容器中攪拌均勻，在真空環境下加熱反應，自然冷卻至室溫，再加入5mL含有NH₄F和NaOH的甲醇溶液，攪拌加熱以除去溶液中的甲醇，然后抽真空通氮氣，梯度升溫，并在氮氣氛圍下保溫；待升溫反應結束后自然冷卻，離心，收集產物，重新分散在5～10mL環己烷溶劑中，加入2～5mL水/乙醇混合溶液，震蕩后靜置分層過夜，收集上層溶液，即得UCNPs，再分散于5～10mL環己烷溶劑中于4℃下保存備用；

2)將UCNPs分散在含有鹽酸的乙醇溶液中，超聲去除UCNPs表面的油酸分子，對UCNPs進行表面改性；

所述對UCNPs進行表面改性的具體方法為：取1～10mg油酸分子包裹的UCNPs，第一次離心后將離心產物分散于1～10mL含有鹽酸的乙醇溶液中，超聲去除UCNPs表面的油酸分子，然后第二次離心，棄去上清液，再將離心產物分散于3～10mL含有鹽酸水乙醇溶液中純化，再第三次離心后棄上清，將產物分散在1～10mL水中備用；

3)在改性后的UCNPs表面修飾與靶標分子有特異性親和的DNA1，制備UCNPs-DNA1；

所述制備UCNPs-DNA1的具體方法為：取步驟2)所得的1mL水溶性UCNPs，加入不同濃度的DNA1水溶液，攪拌后離心，離心產物重分散在5～10mL的水或Tris-HCL緩沖液中；

所述不同濃度的DNA1水溶液的濃度為0.1～100μM；所述攪拌是在400～600rpm下攪拌6～24h；所述離心的速率為8000～13000r/min，離心的時間為10～20min；所述水采用超純水；所述Tris-HCL緩沖液為20～50mM，5～50mM MgCl₂，50～100mM NaCl，pH 7.4～8；

所述DNA1通過5’末端官能化基團與稀土離子強配位作用修飾在UCNPs表面，所述DNA1的5’末端官能化基團選自羧酸基團、磷酸基團、磺酸基團中的一種；

所述DNA1序列為：5’-TTTTTTTTTCTTGCCTACGCCACTAGCTC-3’或

5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’；

4)構建UCNPs-DNA1與熒光猝滅基團的近紅外熒光納米生物傳感器，具體方法為：將UCNPs-DNA1溶液與熒光猝滅基團溶液以不同比例在Tris-HCL緩沖液中混合，總體積為200μL，然后置于37℃恒溫搖床中反應，反應結束后，將溶液離心，將近紅外熒光納米生物傳感器分散在1～5mL Tris-HCL緩沖液中；

所述UCNPs-DNA1溶液與熒光猝滅基團溶液的摩爾比為1︰(0.1～10)；所述反應的時間為1～3h；所述離心的速率為8000～12000r/min，離心的時間為10～20min；所述Tris-HCL緩沖液為20～50mM，5～50mM MgCl₂，50～100mM NaCl，pH 7.4～8；

所述熒光猝滅基團選自BHQ1、BHQ2、TAMRA、金納米顆粒、氧化石墨烯中的一種；所述熒光猝滅基團修飾有與DNA1部分互補的DNA2；所述DNA2序列為：5’-GTGGCGTAGGCAAGTTTTTTTTT-3’或5’-AGACAACACGTGCCCAAC-3’。