[發明專利]一種用雙酶串聯制備L-2-氨基丁酸的方法

有效

• 申請號: 202010058267.1
• 申請日: 2020-01-18
• 公開（公告）號: CN111172213B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 周哲敏;劉中美;劉宇鋒;周麗;崔文璟;郭軍玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N9/90;C12N9/88;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種用雙酶串聯制備L?2?氨基丁酸的方法，屬于生物工程領域。本發明通過分別培養表達L?谷氨酸變位酶和L?天冬氨酸?β?脫羧酶的重組大腸桿菌，獲得L?谷氨酸變位酶和L?天冬氨酸?β?脫羧酶。將兩種酶以一定質量比添加到反應體系中，以L?谷氨酸為底物，進行酶反應制備L?2?氨基丁酸，當L?天冬氨酸?β?脫羧酶的用量為2mg/mL，反應24h，轉化生成8.5mmol/L L?2氨基丁酸，摩爾轉化率為85.00％。此法與化學生產法相比，生產工藝安全，無環境污染。與以蘇氨酸為底物的多酶合成體系相比，底物價格更便宜，工藝更簡單。

技術領域

本發明涉及一種用雙酶串聯制備L-2-氨基丁酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一種非蛋白質氨基酸，是重要的藥物中間體，被廣泛用于醫藥、農藥及食品領域，例如，可用來合成抗癲癇藥物左乙拉西坦和抗結核藥物乙胺丁醇、布瓦西坦等。目前L-2-氨基丁酸的合成方法主要包括化學合成法、生物合成法兩種。L-2-氨基丁酸的化學不對稱合成需用到劇毒化學試劑氰化物和溴素等作為合成原料，再使用化學手性拆分劑實現消旋型中間產物的拆分。反應過程存在劇毒化合物、環境污染嚴重、產品手性純度低以及高溫高壓等反應條件苛刻等缺點。與化學合成法相比，生物催化法合成L-2-氨基丁酸具有無可比擬的優勢。生物合成主要有兩種，一種是酶拆分法，混旋型DL-2-氨基丁酸被相應的酶催化生成L-2-氨基丁酸，但是理論產量只有50％；另一種是酶合成法，底物是蘇氨酸，蘇氨酸在蘇氨酸脫氫酶的作用下生成2-酮丁酸，2-酮丁酸在轉氨酶或脫氫酶作用下被還原成L-2-氨基丁酸，該方法存在需要大量的氨基供體、輔因子再生系統和底物價格高的缺點，不適合工業生產。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的第一個目的是提供一種生物合成L-2-氨基丁酸的方法，是以L-谷氨酸為底物，以雙酶串聯體系催化L-谷氨酸生成L-2-氨基丁酸；所述雙酶是L-谷氨酸變位酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶；所述雙酶串聯體系中，底物L-谷氨酸的濃度為10-30mmol/L；L-谷氨酸變位酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶按照4-6:1的質量比例添加到雙酶串聯體系中，其中，所述L-天冬氨酸-β-脫羧酶的用量為0.5-5mg/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述雙酶串聯體系中，底物L-谷氨酸的濃度是10-20mmol/L，L-谷氨酸變位酶和L-天冬氨酸-β-脫羧酶按照4-6:1的質量比添加到雙酶串聯體系中。

在本發明的一種實施方式中，L-天冬氨酸-β-脫羧酶的用量為2-3mg/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述的雙酶串聯體系中還含有0.5-1.5mmol/L二硫蘇糖醇、0.5-1mmol/L的磷酸吡哆醛、0.01-0.02mmol/L的腺苷鈷胺素、1-1.5mmol/Lα-酮戊二酸以及18-22mM pH 6.5-7.5的K₂HPO₄/KH₂PO₄緩沖液。

在本發明的一種實施方式中，催化反應的溫度為35-39℃，反應10-30h。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述L-谷氨酸變位酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。