[發明專利]一種臍帶來源原代間充質干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202010058155.6
• 申請日: 2020-01-18
• 公開（公告）號: CN111117954A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 姚遠;鞏燕山;杜亞靜;鄭曉光
• 申請（專利權）人: 北京永華燕蕓生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種臍帶來源原代間充質干細胞的分離培養方法，屬于生物技術領域。本發明的分離培養方法包括組織的保存液的配制、臍帶采集、臍帶消毒清洗、華通氏膠分離、華通氏膠剪碎、離心分離和接種處理。本發明以人臍帶為材料提取原代間充質干細胞，提取培養過程無需消化酶，對組織內細胞無傷害，原代細胞分離也無需過濾，提高了提取效率；本發明的培養周期短，效率高，獲得的原代間充質干細胞穩定。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種臍帶來源原代間充質干細胞的分離培養方法。

背景技術

臍帶間充質干細胞（UMSCs）具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化。它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、內皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應用前景。從人臍帶中分離出MSCs，且細胞含量、增殖能力強，免疫原性低，并且具有取材方便，無倫理學爭議等優點，因此越來越受到研究工作者們的關注。

臍帶間充質干細胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞。臍帶間充質是一類低免疫原性細胞，且具有很強的免疫調節功能。臍帶間充質干細胞擁有MSC的全部特性，并且含量豐富，易于分離培養。

臍帶間充質干細胞具有多分化潛能，在特定的誘導條件下，UC-MSC不僅能分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱等中胚層細胞，而且能夠向內胚層組織細胞(如心肌細胞、肝細胞)和外胚層組織細胞(如神經細胞)分化。UC-MSC不具致瘤性，能在不同的誘導條件及合適的體內生長微環境中，安全地定向分化為不同的組織細胞系，具有修復各種組織和器官的能力。

人臍帶是一種膠狀的結締組織，如何高效地從臍帶中分離臍帶間充質干細胞是一直以來的難題。原代臍帶間充質干細胞的最常見分離方法包括酶消化法。酶消化培養法的經濟成本高，通常需要使用專用的消化設備，消化時間長，一般4～5h，且消化程度不易把控，消化不夠，無法得到足夠數量的細胞，消化時間過久，使用的酶對細胞的損傷大，導致細胞發生損傷、老化聚團，得到的細胞增殖活性不佳，無法在體外快速擴增，獲得大量臍帶間充質干細胞。且由于消化液為黏稠液體，離心時不易分離出細胞。

發明內容

本發明的目的是為了提供一種臍帶來源原代間充質干細胞的分離培養方法，該方法對組織內細胞損傷小，可更大范圍的保護充質干細胞的活性和分化潛能，縮短分離時間同時，縮短爬出細胞出現的時間，具有工藝簡便、生產成本低、重復性好。

本發明的上述發明目的是通過以下技術方案得以實現的：

一種臍帶來源原代間充質干細胞的分離培養方法，包括下列步驟：

S1、保存液的配制，將生理鹽水和雙抗溶液配制成的保存液放入取樣瓶，4℃冷藏保存；

S2、臍帶采集，在無菌條件下采集臍帶組織，并置于保存液中，0-4℃冷藏運輸，24小時內對臍帶組織進行處理；

S3、臍帶消毒清洗，將取樣瓶中的臍帶取出，置于無菌燒杯中，燒杯放入75%酒精，快速漂洗臍帶不超過3分鐘，并去除臍帶兩頭各1cm；使用工作液清洗臍帶，直至清洗后的溶液基本無色為止；

S4、華通氏膠分離，將臍帶進行機械分離，獲得剝離的華通氏膠；

S5、華通氏膠剪碎，將華通氏膠剪碎成小于2mm³的組織塊；

S6、離心分離，將剪碎的華通氏膠放入無菌燒杯中加5-20ml生理鹽水混懸，將細胞組織懸液轉移至50ml離心管，生理鹽水補足45ml，進行離心處理，去除上清液，取離心沉淀；

S7、接種處理，取多個T175培養瓶，每個T175培養瓶加入10ml DF-12培養基，用移液管或藥匙按每1-3ml離心沉淀接種于一個T175培養瓶中，搖勻，均勻平鋪到培養瓶底部，并置于培養箱中培養。

上述的臍帶來源原代間充質干細胞的分離培養方法，其中，步驟S1中、保存液中的雙抗濃度為10％。