[發明專利]基因工程化大腸桿菌及褪黑素的生產方法

有效

• 申請號: 202010057352.6
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111154707B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 祁峰;黃建忠;沈培杰;楊金花;江賢章;李清晨;林金新
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P17/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京悅成知識產權代理事務所(普通合伙) 11527
• 代理人: 樊耀峰;高艷麗

本發明公開了一種基因工程化大腸桿菌及褪黑素的生產方法。本發明的基因工程化大腸桿菌包含N?乙酰轉移酶基因和O?甲基轉移酶基因，且所述N?乙酰轉移酶基因和O?甲基轉移酶基因能夠在所述大腸桿菌的胞內表達，形成具有活性的N?乙酰轉移酶和O?甲基轉移酶。本發明利用基因工程化大腸桿菌生產褪黑素，反應條件溫和。

技術領域

本發明涉及一種基因工程化大腸桿菌及褪黑素的生產方法。

背景技術

褪黑素是由哺乳動物大腦中的松果體合成的一類具有生物活性的物質，化學名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺。從結構上看，褪黑素是一種色氨酸衍生物，具有1個吲哚母環、1個側鏈乙酰胺基團和1個芳環取代甲氧基。

在制藥與保健品領域，褪黑素作為一種內分泌激素，可以通過調節晝夜節律作用，從而改善人類睡眠、延緩衰老。在農業中，褪黑素的用途也十分廣泛。外源添加的褪黑素可以促進植物種子發芽和幼苗生長。此外，褪黑素還可以刺激植物免疫系統，提高植物抗逆性。

通常，褪黑素可以通過復雜的化學方法合成。例如，CN110229092A公開了一種化學合成褪黑素的方法，以5-甲氧基吲哚、碳酰氯和氫化鋁鋰為原料通過多步反應制備得到褪黑素。又如，CN104496882A公開了一種褪黑素的合成方法，由丙二酸二乙酯與丙烯腈為原料，經過加成、酯的氨解、偶合、重排、酰胺的水解、脫羧及酰化等步驟得到褪黑素。化學合成法步驟繁瑣、污染大且得率底。

此外，褪黑素還可以從動植物組織中提取。CN109258464A公開了一種通過新疆雪蓮愈傷組織合成褪黑素的方法。將新疆雪蓮愈傷組織在黑暗環境中預處理，然后將預處理得到的新疆雪蓮愈傷組織在低氣壓環境中進行光照培養而獲得褪黑素。動植物組織提取法存在原料供應少、提取率低的問題。

近年來，生物催化方法取得快速進展，其具有工藝簡單、生產周期短、易于放大等優勢，有望成為大規模生產褪黑素的理想途徑。但是，現有技術中缺少相關途徑的探索和研究。本領域內仍然需要生物合成褪黑素的新方法。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種基因工程化大腸桿菌，其具有產生N-乙酰轉移酶和O-甲基轉移酶的能力。本發明的另一個目的在于提供上述基因工程化大腸桿菌的制備方法。本發明再一個目的在于提供一種褪黑素的生產方法，其利用上述基因工程化大腸桿菌進行褪黑素的微生物合成。

大腸桿菌屬于埃希氏菌屬，革蘭氏陰性菌，是人腸道的普遍寄生菌。它可以在很多類型的培養基上生長，繁殖速度快，一般對人無毒無害。大腸桿菌的基因組約為4.6MB，屬于人類最早測序的生物之一。

本發明發現將來自于人源基因組的N-乙酰轉移酶和來自于水稻基因組的O-甲基轉移酶基因轉化到大腸桿菌進行表達，產生具有活性的N-乙酰轉移酶和O-甲基轉移酶，從而可以將底物血清素轉化為褪黑素。至少基于上述部分發現完成了本發明。具體地，本發明包括以下內容。

一方面，本發明提供一種基因工程化大腸桿菌，其包含N-乙酰轉移酶基因和O-甲基轉移酶基因，且所述N-乙酰轉移酶基因和O-甲基轉移酶基因能夠在所述基因工程化大腸桿菌的胞內表達，形成具有活性的N-乙酰轉移酶和O-甲基轉移酶。

本發明的基因工程化大腸桿菌表示對常規的大腸桿菌通過基因重組技術改造得到的菌株。根據本發明的一個實施方式，通過基因重組技術在那些不具有或缺少N-乙酰轉移酶和O-甲基轉移酶活性的野生型或其它人工改造大腸桿菌中引入外來物種的基因來使這些基因表達，從而產生或帶來增量的N-乙酰轉移酶和O-甲基轉移酶活性，從而獲得基因工程化大腸桿菌。優選地，常規的大腸桿菌可以為大腸桿菌(Escherichia coli)MG1655，其可購自ATCC(保藏編號ATCC700926)。這些大腸桿菌屬于市售產品，因而不需要額外的保藏證據及遺傳資源登記資料。