[發明專利]一種構建古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202010056078.0
• 申請日: 2020-01-18
• 公開（公告）號: CN111398579A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 孫素榮;美麗排提·玉素甫;阿來·沙力塔那;蔣柏勇;李軼杰
• 申請（專利權）人: 新疆大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N15/40;C12N15/70;C07K14/08
• 代理公司: 西安亞信智佳知識產權代理事務所(普通合伙) 61241
• 代理人: 段國剛

1.一種古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法及應用，該方法的具體步驟如下：

（1）將具有KpnⅠ和NotⅠ酶切位點的合成NP基因連接入pET-32a(+)空載體，構建的pET-32a-NP載體轉化至E.coli BL21感受態細胞；

（2）將步驟（1）中制備獲得的E.coli BL21感受態細胞加入含氨芐青霉素（A＋）的培養基中大量繁殖過夜后，以1：1000的比例加入IPTG誘導劑后培養4 h；

（3）將步驟（2）中獲得的將誘導后菌液離心后去培養基，沉淀用1×PBS溶解，利用超聲細胞破碎儀破碎細胞，離心后取沉淀，用6 mol/L濃度的尿素溶解變性，繼續離心后得到上清，用20 mmol/L-500mmol/L咪唑濃度來洗脫，洗脫獲得rNP；

（4）用抗原稀釋液稀釋步驟（3）中獲得的rNP抗原包被液至2-8 μg/mL，以200 μL的體積加入孔中，靜置于4℃過夜，PBST洗15 min；

（5）分別用0-5%脫脂奶粉的封閉液以200 μL的體積加入孔中，在37℃培養箱中封閉2h，PBST洗15 min；

（6）GTV陰性和陽性羊、人血清以1:100-400稀釋度稀釋，以每孔加入100 μL，37℃孵育15-90 min，PBST洗25 min；

（7）加入HRP標記的兔抗羊或兔抗人酶標二抗，以1:-10000稀釋度稀釋，每孔加入100 μL，37℃培養箱中孵育15-90min后，PBST洗20 min；

（8）以1:1體積比例加入TMB A液及B液底物顯色液，每孔加入100 μL，置于黑暗處5-25min后，加入終止液，每孔加入50 μL。

2.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，咪唑采用200 mmol/L濃度進行洗脫。

3.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，rNP抗原包被液濃度選用4 μg/mL。

4.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，封閉液中的脫脂乳粉濃度為3%。

5.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，GTV陰性和陽性羊、人血清稀釋度為1:100。

6.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，GTV陰性和陽性羊、人血清孵育時間為45 min。

7.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，酶標二抗的稀釋度為1:2000。

8.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，酶標二抗的孵育時間為30 min。

9.如權利要求1所述的古爾圖病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，TMB顯色時間為25 min。