[發明專利]敲除斑馬魚p2rx2基因的方法在審
| 申請號： | 202010054360.5 | 申請日： | 2020-01-17 |
| 公開（公告）號： | CN111118009A | 公開（公告）日： | 2020-05-08 |
| 發明（設計）人： | 謝鼎華;賴若沙;謝華平;董運鵬;謝繽靈;付貴芳;曾婷;杜涵 | 申請（專利權）人： | 中南大學湘雅二醫院 |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京集佳知識產權代理有限公司 11227 | 代理人： | 溫可睿 |
| 地址： | 410000 湖南*** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 斑馬 p2rx2 基因 方法 | ||
1.靶向斑馬魚p2rx2基因的gRNA，包括啟動子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.根據權利要求1所示的gRNA，其特征在于，所述啟動子元件的序列如SEQ ID NO:3所示；所述骨架序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根據權利要求1所示的gRNA，其特征在于，包括SEQ ID NO:5～6所示的兩條gRNA。
4.靶向斑馬魚p2rx2基因的敲除試劑，其特征在于，包括權利要求1～3任一項所述的gRNA和Cas9 mRNA。
5.根據權利要求4所述的敲除試劑，其特征在于，敲除試劑中包括Nuclease free H2O和如下濃度的：
MgCl2 10mmol/L；
Cas9 mRNA 150ng/μL；
gRNA 各20ng/μL。
6.權利要求4或5所述的敲除試劑在構建p2rx2基因缺失型斑馬魚模型中的應用。
7.一種構建p2rx2基因缺失型斑馬魚模型的方法，其特征在于，將權利要求4或5所述的敲除試劑接入一細胞期的斑馬魚受精卵內，孵化獲得p2rx2基因缺失型斑馬魚模型。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，每個受精卵給予1.5～2.0nL權利要求4或5所述的敲除試劑。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述孵育后還包括篩選的步驟；所述篩選包括：對受精36h后的胚胎進行篩選，或對成魚進行篩選；
所述篩選包括對基因組DNA進行擴增后進行Sanger測序或根據電泳結果進行篩選；擴增產物包含227bp和322bp大小的條帶則p2rx2基因缺失，擴增產物僅有322bp大小的片段則p2rx2基因未缺失；所述擴增的引物序列如SEQ ID NO:7～8所示。
10.根據權利要求7～9任一項所述的方法，其特征在于，所述孵化獲得的p2rx2基因缺失斑馬魚為F0代；所述方法還包括傳代的步驟；
F1代斑馬魚由F0代斑馬魚與野生型的斑馬魚雜交獲得；
F2代斑馬魚由F1代突變體雜交獲得。
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