[發(fā)明專利]一種蔗糖磷酸化酶在制備甘油葡萄糖苷中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010053780.1
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111172127A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳小龍;甘恬;朱林江;陸躍樂;范永仙;陳翰馳
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/75;C12P19/18;C12P19/44
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種蔗糖磷酸化酶在制備甘油葡萄糖苷中的應(yīng)用，將SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶基因lrsp克隆至枯草芽孢桿菌表達質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pP43?lrsp，并將其轉(zhuǎn)化到表達菌株枯草芽孢桿菌WB800中，構(gòu)建重組菌枯草芽孢桿菌WB800(pP43?lrsp)。該重組菌經(jīng)過發(fā)酵，分泌型表達蔗糖磷酸化酶。將發(fā)酵液經(jīng)過稀釋后直接用于制備2?αGG，其以蔗糖作為糖基供體，以丙三醇作為糖基化受體，具有催化效率高，生產(chǎn)速率快的特點，30?40h內(nèi)催化得到87?110g/L的2?αGG，平均生產(chǎn)強度大于2.1g·L^?1·h^?1。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種甘油葡萄糖苷的制備，特別一種蔗糖磷酸化酶在制備2-O-α-D-甘油葡萄糖苷中的應(yīng)用。

(二)技術(shù)背景

2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)是由各種植物、藻類和異樣細菌為適應(yīng)鹽脅迫和干旱等極端條件而產(chǎn)生的相容性溶質(zhì)，2-αGG是甘油分子上的二號位羥基被葡萄糖基化的產(chǎn)物，即通過糖苷鍵將一個D-吡喃葡萄糖與甘油的二號位羥基偶聯(lián)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，其化學(xué)名為α-D-吡喃葡萄糖基-α-(1-2,2)-丙三醇，是一種有強效保濕、抗衰老、舒緩、修復(fù)、細胞激活多功能的活性化妝品原料。2-αGG不僅適用于日常肌膚的護理，而且同樣適用于抗疲勞、抗環(huán)境壓力(如UV輻射、PM2.5緩解污染)、抗衰老、抗敏感性、抗?jié)裾钚缘确矫妫凰瑫r還具有無致齲性，也可以作為一種無致齲性的甜味劑，添加到食品中；而且它還是一種大分子物質(zhì)的穩(wěn)定劑，可用于蛋白質(zhì)藥物等的長期保存；此外，研究發(fā)現(xiàn)還具有治療過敏性呼吸系統(tǒng)疾病、保護眼角結(jié)膜、降低血糖和控制內(nèi)臟脂肪積累等人體保健的功效。

蔗糖磷酸化酶(Sucrosephosphorylase，SPase,EC 2.4.1.7)屬于糖苷水解酶GH13家族，能夠催化葡萄糖基的特異性轉(zhuǎn)移，具備小分子化合物糖基化功能。相比于其他具有轉(zhuǎn)糖苷能力的生物酶來說，蔗糖磷酸化酶具有糖基供體底物廉價易得，糖基受體底物廣泛，反應(yīng)區(qū)域選擇性高，不水解糖基化產(chǎn)物等優(yōu)點。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是芽孢桿菌屬的一種土壤來源的革蘭氏陽性細菌，具有優(yōu)良的蛋白質(zhì)分泌能力，被廣泛用于工業(yè)酶的生產(chǎn)和蛋白質(zhì)的異源表達。枯草芽孢桿菌作為表達宿主具備以下優(yōu)點：其在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生任何內(nèi)毒素、無致病性，被認為是一種GRAS安全菌株；枯草芽孢桿菌只有一層膜，不具有外膜結(jié)構(gòu)，所以產(chǎn)物可以被分泌到細胞外，極大地簡化了產(chǎn)品的后續(xù)分離純化步驟；營養(yǎng)要求低；遺傳背景清晰，方便進行基因改造及代謝組學(xué)分析；已有大量關(guān)于其轉(zhuǎn)錄和翻譯機制、大規(guī)模發(fā)酵的信息；無顯著密碼子使用偏好性等。因為其特有的優(yōu)勢，枯草芽孢桿菌已成為了目前生產(chǎn)各種工業(yè)酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的理想宿主菌株。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種蔗糖磷酸化酶在高效制備2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)中的應(yīng)用，實現(xiàn)生物法一步催化轉(zhuǎn)化，高效生產(chǎn)2-αGG。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種蔗糖磷酸化酶在制備2-O-α-D-甘油葡萄糖苷(2-αGG)中的應(yīng)用，所述蔗糖磷酸化酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2，編碼基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

進一步，所述的應(yīng)用方法為：以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液作為催化劑，以蔗糖作為糖基供體，以丙三醇作為糖基化受體，以pH為4.0-9.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在25-55℃、磁力攪拌條件下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得含2-αGG的反應(yīng)液，經(jīng)分離純化得到2-αGG產(chǎn)品。所述反應(yīng)體系中，濕菌體含量為5-50g/L(優(yōu)選5-20g/L)，蔗糖的終濃度為200-500g/L(優(yōu)選250-400g/L，最優(yōu)選300g/L)，丙三醇終濃度為20-300g/L(優(yōu)選90-180g/L，最優(yōu)選90g/L)。

進一步，所述發(fā)酵液先用相應(yīng)的緩沖液作適當(dāng)倍數(shù)稀釋作為催化酶液；再加入蔗糖和丙三醇，緩沖液溶制成反應(yīng)體系。