[發(fā)明專利]一種多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010052709.1
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111286487A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莫毅;梁紅;吳曼惠
• 申請（專利權(quán)）人: 南寧摩米生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 廣州辰聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44513
• 代理人: 李艷

1.一種多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）獲取PBMC：取腫瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴細胞分離密度梯度離心法分離出PBMC；

（2）洗滌PBMC：將步驟（1）所得PBMC細胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌一次；

（3）調(diào)整PBMC細胞濃度：用所述基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基對步驟（2）所得的PBMC的細胞濃度進行調(diào)整；

（4）培養(yǎng)瓶處理：將T175細胞培養(yǎng)瓶用包被液包被處理1-2h后，倒出包被液并用生理鹽水潤洗一遍；

（5）第一次增殖培養(yǎng)：將步驟（3）所得PBMC置于步驟（4）所得T175細胞培養(yǎng)瓶中，并利用第一次增殖培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)至第3d；

（6）第二次增殖培養(yǎng)：補加第0d一倍體積的第二次增殖培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)至第5d；

（7）第三次增殖培養(yǎng)：補加第3d一倍體積的第三次增殖培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)至第7d；

（8）第四次增殖培養(yǎng)：將經(jīng)過步驟（7）增殖培養(yǎng)后的細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋中，補加第四次增殖培養(yǎng)基至500mL繼續(xù)增殖培養(yǎng)；

（9）第五次增殖培養(yǎng)：每隔2-3d補加300-500mL的第五次增殖培養(yǎng)基300-500mL，第17-20d收獲細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（3）中所得PBMC細胞濃度為1-2×10⁶個/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（4）中包被液為0.01-5.0mg/mL的CD3單克隆抗體和0.01-5.0mg/mL的CD16單克隆抗體的混合液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為ALys505N-0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第一增殖培養(yǎng)基是以ALys505N-0培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滅活人體血清、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分別為：5%-10%、500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第二增殖培養(yǎng)基和第三增殖培養(yǎng)基均是以ALys505N-0培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分別為：500U/mL、20ng/mL、20ng/mL和20ng/mL。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第四增殖培養(yǎng)基是以ALys505N-0培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的含量分別為：500U/mL、10ng/mL、10ng/mL和10ng/mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述多細胞因子誘導的高純度NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第五增殖培養(yǎng)基是以ALys505N-0培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，IL-2的含量為500U/mL。