[發明專利]grx S16和grx C5基因雙缺失的新孢子蟲弱毒蟲株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010051678.8
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111187722B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 劉群;宋星桔;劉晶;王臣榮;許建海
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/11
• 分類號: C12N1/11;C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/6893;A61K39/002;A61P33/02;C12R1/90
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛芹

本發明公開了一種grx S16和grx C5基因雙缺失的新孢子蟲弱毒蟲株及其構建方法和應用。該蟲株缺失了新孢子蟲的谷氧還蛋白S16基因(grx S16)和谷氧還蛋白C5基因(grx C5)，grx S16基因和grx C5基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發明所構建的新孢子蟲grx S16和grx C5雙基因缺失蟲株的繁殖能力和毒力均顯著降低，接種小鼠后能夠有效抵抗新孢子蟲的再感染，具有成為新孢子蟲弱毒疫苗的潛力。

技術領域

本發明是關于基因工程領域，特別是關于一種grx S16和grx C5基因雙缺失的新孢子蟲弱毒蟲株及其構建方法和應用。

背景技術

新孢子蟲是一種專性細胞內寄生原蟲，新孢子蟲病是多種動物共患的寄生蟲病，在世界范圍內廣泛流行。對牛和犬的危害尤為嚴重，主要造成孕畜流產、死胎以及新生幼畜的神經系統功能障礙，新孢子蟲感染是引起奶牛流產的重要原因之一。迄今為止，尚無有效的疫苗或藥物用于防治動物新孢子蟲病。目前對新孢子蟲病最有效的防控措施是在有效檢測的基礎上，淘汰感染牛只，凈化牛群。因此，構建有研發前景的新孢子蟲弱毒疫苗的意義重大。

谷氧還蛋白(glutaredoxin，grx)是多種生物體中普遍存在的一種重要的氧化還原酶，它與硫氧還蛋白家族一同維持著機體內的氧化還原平衡。谷氧還蛋白以谷胱甘肽作為直接電子供體，調節細胞含巰基蛋白的氧化還原狀態，谷氧還蛋白系統作為一種細胞內氧化還原態勢的重要調節系統在細胞信號轉導過程中發揮重要作用。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種grx S16和grx C5基因缺失的新孢子蟲弱毒蟲株，該蟲株具有繁殖能力和毒力顯著下降的特點，用該蟲株免疫小鼠能有效抵抗新孢子蟲的攻擊，有作為新孢子蟲弱毒疫苗的潛力。

為實現上述目的，本發明提供了一種grx S16和grx C5基因雙缺失的新孢子蟲弱毒蟲株(Δgrx S16Δgrx C5)，所述新孢子蟲弱毒蟲株中缺失的grx S16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述新孢子蟲弱毒蟲株中缺失的grx C5基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本發明還提供了一種grx S16和grx C5基因雙缺失的新孢子蟲弱毒蟲株的構建方法，包括以下步驟：基礎新孢子蟲蟲株的準備：選用新孢子蟲國際標準株Nc1，該標準株Nc1含有grx S16基因和grx C5基因，所述grx S16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述grx C5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；質粒構建：通過PCR擴增、多片段連接獲得構建所述新孢子蟲弱毒蟲株所需要的四個質粒，分別是pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx S16質粒、pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx C5質粒、grx S16-5'UTR::DHFR::grx S16-3'UTR質粒和grx C5-5'UTR::CAT::grx C5-3'UTR同源模板質粒；以及弱毒蟲株的獲得：利用同源重組的方法，將所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx S16質粒和所述grx S16-5'UTR::DHFR::grx S16-3'UTR同源模板質粒片段電轉到所述Nc1蟲株中，經過藥物篩選、單克隆篩選和PCR鑒定獲得grx S16基因缺失的新孢子蟲弱毒蟲株；進一步將pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx C5質粒和grx C5-5'UTR::CAT::grx C5-3'UTR同源模板質粒電轉至上述grx S16基因缺失的新孢子蟲弱毒蟲株中，經過藥物氯霉素篩選、單克隆篩選和PCR鑒定獲得權利要求1所述的grx S16和grx C5基因雙缺失的新孢子蟲弱毒蟲株。

在本發明的一實施方式中，所述pSAG1-Cas9-NcU6-sggrx S16質粒是以pSAG1-Cas9-NcU6-sggra17為模板，將gra17靶點特異的gRNA替換為基因grx S16靶點特異的gRNA所得到的。