[發明專利]一種轉基因水稻雜草化基因漂移風險的評估方法及應用

有效

• 申請號: 202010050883.2
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111139311B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 強勝;宋小玲;戴偉民;張晶旭;王敏;李雷
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;A01H1/02;A01G22/22
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

1.一種轉基因水稻雜草化基因漂移風險的評估方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：通過分期將轉基因水稻與雜草稻分別作為花粉供體和受體通過隔行種植或包圍種植的方式混種；

當采用隔行種植時，分別收集轉基因水稻后代種子與雜草稻后代種子；

當采用包圍種植時，只需收集作為花粉受體的后代種子；

S2：收集種子后，采用分步抽樣法抽取所需種子用于基因漂移檢測，具體如下：

S21：采用隨機抽樣的方法，從收獲的種子中抽取20000粒種子；

S22：若得到的基因漂移率大于0.2％，則不必繼續增加抽樣量；

若得到的基因漂移率小于0.2％，則需再檢測10000粒種子；在此基礎上，若得到的基因漂移率大于0.05％，則不需要增加種子檢測量；

若得到的基因漂移率小于0.05％，還需再檢測10000粒種子；在此基礎上，若得到的基因漂移率大于0.025％，則不需要增加種子檢測量；

S3：對轉基因水稻向雜草稻基因漂移率，即正向基因漂移率進行檢測，具體如下：

S31：對收獲的雜草稻種子打破休眠后進行發芽率檢測，把裝有100粒種子的培養皿放置于30℃光照培養箱培養7d，測定發芽率，試驗重復4次，每種受體材料抽樣方法采用S2所述的分步抽樣法；

S32：根據作為標記基因的抗性基因，選擇對應的抗性篩選方法；將經過篩選出來的幼苗移栽在育苗盤內培養至3葉期，采取葉片，進行分子檢測；

S33：計算正向基因漂移率：正向基因漂移率＝[抗性種子數/(檢測種子總數×發芽率)]×100％；

S4：對雜草稻向轉基因水稻基因漂移率，即反向基因漂移率進行檢測，針對的反向基因漂移率小于0.5％時，具體如下：

S41：基于S2所述的分步抽樣法，在抽取的轉基因水稻種子樣本中隨機抽樣60粒作為一組，并進行脫殼磨樣；將脫殼磨樣后的樣品進行DNA提取；

S42：將提取到的DNA利用Rc基因的擴增引物進行Rc基因檢測，根據是否存在104bp和118bp的擴增片段，來判斷該樣品中是否存在雜草稻向轉基因水稻漂移形成的雜交種；若存在104bp和118bp的擴增片段，則該組水稻中存在一粒由于雜草稻花粉漂移到轉基因水稻種子產生的雜交種子；

所述Rc基因的擴增引物序列為：

上游引物：5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′；

下游引物：5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′；

S43：重復步驟S41～S42，直至樣本全部檢測完；并計算反向基因漂移率：反向基因漂移率＝(發生基因漂移的粒數/樣本總粒數)×100％；

S5：統計正向基因漂移率和反向基因漂移率，最終得出基因漂移率：基因漂移率＝(正向基因漂移率+反向基因漂移率/2)×100％。

2.根據權利要求1所述的一種轉基因水稻雜草化基因漂移風險的評估方法，其特征在于，所述步驟S1中，所述隔行種植為：在轉基因水稻間，間隔5天分4批移栽隔行種植雜草稻；所述包圍種植為：一次種植花粉供體，間隔5天分4批圍繞種植花粉受體；或一次種植花粉受體，間隔5天分4批圍繞種植花粉供體。

3.根據權利要求1所述的一種轉基因水稻雜草化基因漂移風險的評估方法，其特征在于，所述步驟S41中：將轉基因水稻種子脫殼磨樣后過60目篩，進行DNA提取的樣品體積為0.5mL，樣品重量為0.342～0.377g，DNA濃度為39.8～77.7μg/mL。

4.根據權利要求1所述的一種轉基因水稻雜草化基因漂移風險的評估方法，其特征在于，所述步驟S42中，Rc基因擴增的PCR反應體系為：2×Taq PCR Mix 4μL，ddH₂O 3.5μL，上、下游引物各0.25μL，DNA 2μL；其中，2×Taq PCR Mix成分為：dNTP 0.2mmol/L each、KCl100mmol/L、Tris-HCl 20mmol/L、Taq Polymerase 5U/100μL、MgCl₂ 3.0mmol/L。