[發明專利]膜蛋白SohB的表達載體及其表達純化方法

有效

• 申請號: 202010049420.4
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN113122561B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 周敏;張苑楨;陳宇航
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C07K14/245;C12R1/19
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

本發明公開了一種膜蛋白SohB的表達載體及其表達純化方法。所述的表達載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，包含：噬菌體T7啟動子；大腸桿菌核糖體結合位點，其中包含NcoI序列CCATGG、SEQ?ID?NO.1所示的大腸桿菌膜蛋白SohB序列以及BamHI位點GGATCC；煙草蝕紋病毒半胱氨酸蛋白酶切割位點GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位點CATATG；超折疊維納斯熒光蛋白編碼序列；XhoI酶切位點CTCGAG；6個組氨酸位點以及終止密碼子TAG。本發明利用分子剛性的熒光蛋白作為篩選標記以及表達進程指示劑，該熒光蛋白由于具有分子水平剛性結構可以迅速折疊，能夠幫助氮端膜蛋白SohB穩定其構象。本發明構建的表達載體能夠實現膜蛋白SohB的大量表達，可用于后續新型抗生素的高通量篩選。

技術領域

本發明屬于蛋白質生產技術領域，涉及一種功能未知轉運蛋白(SohB)的表達載體及其表達純化方法。

背景技術

細胞膜是細胞內部與外部的邊界，擔負著信息傳遞、能量傳輸和物質交換的重要功能，是最重要的細胞器。藥物作用的靶點經常位于細胞膜上。目前已知50％以上藥物作用的靶標是膜蛋白。因此，對于膜蛋白的研究具有非常重要的意義。

然而，膜蛋白由于其天然狀態的含量稀少，具有多次跨膜結構，因而折疊容易出現錯誤，結構復雜，所以膜蛋白的大規模制備一直是難點和熱點。在國內，基本沒有生物公司可以做到12次以上的跨膜蛋白的表達，只有一兩家公司可以做到四次跨膜蛋白的表達。

大腸桿菌作為常用的表達宿主一直是蛋白表達的首選，然而，即使是大腸桿菌自身蛋白都很難在大腸桿菌中大量表達。目前，由于抗生素的濫用，導致在今后的50年內面臨無法對抗耐藥菌的窘境。因此通過大量表達膜蛋白作為抗生素的作用靶點，為后續非變性質譜的高通量篩選提供先導性技術支持。

發明內容

本發明的目的在于提供一種大量表達膜蛋白SohB的表達載體及其表達純化方法。本發明針對大腸桿菌膜蛋白SohB，建立高效的融合表達系統，可以用于后續進一步的蛋白質非變性實時監控質譜研究。

實現本發明目的的技術方案如下：

本發明的膜蛋白SohB的表達載體，以本實驗室獲得的用于萊茵衣藻蛋白質定位的超折疊維納斯熒光蛋白(中國專利申請201910347575.3)作為起始蛋白質骨架，通過對序列表達所用的密碼子組成進行進一步優化，獲得分子剛性的熒光蛋白表達標簽并且適用于大腸桿菌膜蛋白的大規模表達。本發明利用分子剛性的熒光蛋白作為篩選標記以及表達進程指示劑，并且該熒光蛋白由于具有分子水平剛性結構可以迅速折疊，并且幫助氮端膜蛋白SohB穩定其構象。

本發明的膜蛋白SohB的表達載體為表達質粒pLy077-SohB(SEQ?ID?NO.2)，包含：噬菌體T7啟動子；大腸桿菌核糖體結合位點，其中包含NcoI序列CCATGG、大腸桿菌膜蛋白SohB序列(SEQ?ID?NO.1)以及BamHI位點GGATCC；煙草蝕紋病毒半胱氨酸蛋白酶切割位點GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位點CATATG；超折疊維納斯熒光蛋白編碼序列；XhoI酶切位點CTCGAG；6個組氨酸位點以及終止密碼子TAG。

本發明還提供上述膜蛋白SohB的表達載體的表達純化方法，具體步驟如下：

步驟1，大腸桿菌膜蛋白SohB表達載體突變株的制備：將膜蛋白SohB的表達載體即表達質粒pLy077-SohB轉化到宿主大腸桿菌中，并涂布于含抗生素以及0.1mM?IPTG瓊脂平板，挑選黃綠色的陽性單克隆菌進行擴大培養和誘導表達；

步驟2，將挑選的突變菌株轉化株接種至培養基中進行擴大培養，并用1mM?IPTG大規模誘導表達膜蛋白SohB。

優選地，步驟1中，所述的大腸桿菌為大腸桿菌DH5α或大腸桿菌BL21(DE3)。

優選地，步驟2中，所述的培養基為LB培養基或TB培養基。