[發(fā)明專利]一種產(chǎn)林可霉素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010049041.5
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111117942B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳海珍;葉江;張惠展;侯兵兵;王瑞達(dá)
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/31;C12R1/565
• 代理公司: 上海華工專利事務(wù)所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

本發(fā)明公開了一種產(chǎn)林可霉素的基因工程菌，其是將林肯鏈霉菌的編碼含TPR結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因敲除和將編碼RNA酶的基因敲除并過表達(dá)林肯鏈霉菌的編碼Xre家族蛋白的基因構(gòu)建獲得。本發(fā)明還公開了一種產(chǎn)林可霉素的基因工程菌的構(gòu)建方法，其是以林肯鏈霉菌為出發(fā)菌株，將林肯鏈霉菌的編碼含TPR結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因敲除和將編碼RNA酶的基因敲除并過表達(dá)林肯鏈霉菌的編碼Xre家族蛋白的基因構(gòu)建獲得產(chǎn)林可霉素的基因工程菌。本發(fā)明的產(chǎn)林可霉素的基因工程菌的構(gòu)建方法，其操作簡便，構(gòu)建獲得的基因工程菌可以提高林可霉素的產(chǎn)量，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種產(chǎn)林可霉素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

林可霉素(lincomycin)是由林肯鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis)產(chǎn)生的一種具有廣泛臨床藥用價值的林可酰胺類抗生素。林可霉素及其衍生物(如氯代衍生物克林霉素)對于厭氧型革蘭氏陽性菌，以及原生動物具有抑制作用。林可霉素通過與核糖體50s亞基中的23s rRNA的中心環(huán)疏水性結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯過程中的多肽鏈轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抑菌功能。林可霉素與大多數(shù)藥用抗生素都不存在交叉抗性，臨床上廣泛用于治療呼吸道、泌尿系統(tǒng)、皮膚及軟組織感染，慢性骨髓炎，腦膜炎，中耳炎和眼科疾病等，特別適用于對內(nèi)酰胺類抗生素有抗性的細(xì)菌感染患者。

過去幾十年的生產(chǎn)實(shí)踐中，林可霉素工業(yè)菌株的獲取主要依靠物理或化學(xué)方法誘變，不但耗時，且隨機(jī)性較大，無法對育種提供理論性指導(dǎo)。林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)水平與其他大宗抗生素相比仍存在較大差距，亟需通過新的技術(shù)手段獲得優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。

TPR(Tetratricopeptide repeat)是一個含34個氨基酸的蛋白重復(fù)序列，編碼一個α螺旋-轉(zhuǎn)角-α螺旋的二級結(jié)構(gòu)片段，通常以前后串連的形式重復(fù)出現(xiàn)在蛋白結(jié)構(gòu)中。前后相連的TPR折疊形成一個介導(dǎo)蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域。含TPR結(jié)構(gòu)域的蛋白廣泛分布于原核和真核生物中，在細(xì)胞中行使各種各樣的功能(細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白折疊與分泌)。目前已有多個含TPR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌中發(fā)揮抗生素合成調(diào)控的功能。目前尚無在林肯鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)TPR調(diào)控林可霉素合成的案例報道。

RNA酶通過在細(xì)胞內(nèi)對RNA加工或降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)量，進(jìn)而廣泛影響包括細(xì)胞生長、形態(tài)分化、核糖體組裝及次級代謝等在內(nèi)的細(xì)胞過程。早期研究發(fā)現(xiàn)，Rnase J是一種同時具有核酸外切和內(nèi)切活性的RNA酶，在天藍(lán)色鏈霉菌和委內(nèi)瑞拉鏈霉菌體內(nèi)影響多種抗生素的生物合成。但目前尚無RNA酶調(diào)控林可霉素合成的案例被報道。

Xre(xenobiotic response element)家族蛋白質(zhì)是一類于真核生物、細(xì)菌和古細(xì)菌都廣泛存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。其結(jié)構(gòu)上包含N末端的發(fā)揮NDA結(jié)合功能的HTH(螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋)結(jié)構(gòu)域，以及C末端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該家族成員已知的生物學(xué)功能包括噬菌體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，細(xì)菌質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制等。編碼Xre家族蛋白的基因廣泛存在于鏈霉菌基因組，但生物學(xué)功能被解析的只有極少數(shù)。目前尚無通過改造Xre家族基因提高林可霉素產(chǎn)量的案例。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明致力于通過基因工程手段定向改造基因，以獲得用于林可霉素及其藥用衍生物工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株。為此，本發(fā)明通過研究，在林肯鏈霉菌野生菌株NRRL 2936的基因組中發(fā)現(xiàn)了多個編碼含TPR結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因，并從中選取了三個基因(slinc566、slinc4481、slinc6027)進(jìn)行了基因敲除嘗試。其中缺失slinc4481基因后，林肯鏈霉菌NRRL2936中林可霉素產(chǎn)量提高了18.7倍，說明SLINC4481是一個參與林可霉素合成過程的負(fù)調(diào)控因子。

同時，本發(fā)明經(jīng)過序列同源分析，林肯鏈霉菌NRRL 2936基因組上的slinc6156基因被發(fā)現(xiàn)編碼Rnase J。缺失slinc6156基因后，林可霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了22.4倍，說明SLINC6156是一個參與林可霉素生物合成過程的負(fù)調(diào)控因子。