[發(fā)明專(zhuān)利]用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞快速高效制備擬胚體的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010048972.3
• 申請(qǐng)日: 2020-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111139218A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜宏偉;崔麗娟;王征宇;杜為;徐迎;張金美;劉容志
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/073
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/073;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 天津才智專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 12108
• 代理人: 王顕

本發(fā)明公開(kāi)了一種用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞快速高效制備擬胚體的方法，將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPS/胚胎干細(xì)胞ES消化為小的細(xì)胞團(tuán)塊或單細(xì)胞；以適當(dāng)濃度接種于培養(yǎng)基；在水平搖動(dòng)條件下培養(yǎng)制備成聚合球體；分離聚合細(xì)胞球體繼續(xù)培養(yǎng)形成擬胚體。本發(fā)明在適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度和適當(dāng)?shù)乃睫D(zhuǎn)動(dòng)搖動(dòng)條件下形成細(xì)胞聚合球體，再對(duì)細(xì)胞球體進(jìn)行分化培養(yǎng)形成擬胚體，本方法無(wú)需額外耗材，操作簡(jiǎn)單，制備通量高，擬胚體形成率高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞快速高效制備擬胚體的方法，快速高效高通量形成擬胚體。

背景技術(shù)

胚胎干細(xì)胞(ES)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)是具有自我更新和全能性的細(xì)胞，具三個(gè)胚層分化能力和分化出所有類(lèi)型細(xì)胞的能力，在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等臨床疾病治療等方面具有巨大的潛在價(jià)值。ES/iPS可以在一定的培養(yǎng)條件下形成具有內(nèi)、中、外三胚層結(jié)構(gòu)，在形態(tài)學(xué)上與哺乳動(dòng)物早期的胚胎發(fā)育階段有著很高相似度的一種球狀結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為擬胚體(Embryoid bodies，EBs)。目前很多分化系統(tǒng)都是基于擬胚體分化體系建立的，如造血干細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，擬胚體及其制備技術(shù)在胚胎發(fā)育研究、再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

傳統(tǒng)的擬胚體制備方法包括懸滴法(hanging drops)和離心法。懸滴法操作復(fù)雜，擬胚體形成效率低，很難大規(guī)模制備。離心法則是利用96孔板或者商品化的微孔結(jié)構(gòu)板材平均分配細(xì)胞，利用離心力將細(xì)胞壓在一起，但這種方法同樣操作復(fù)雜，且離心后的細(xì)胞成呈片狀堆積，無(wú)法直接形成球狀結(jié)構(gòu)，形成的擬胚體結(jié)構(gòu)松散，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基后易解體為單細(xì)胞，影響后序分化發(fā)育。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種成本低，操作簡(jiǎn)便，快速高效的用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞快速高效制備擬胚體的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞快速高效制備擬胚體的方法，包含如下步驟：

1)將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPS/胚胎干細(xì)胞ES消化為小的細(xì)胞團(tuán)塊或單細(xì)胞；

2)以適當(dāng)濃度接種于培養(yǎng)基；

3)在水平搖動(dòng)條件下培養(yǎng)制備成聚合球體；

4)分離聚合細(xì)胞球體繼續(xù)培養(yǎng)形成擬胚體。

具體包含如下步驟：

1)將iPS/ES細(xì)胞使用適當(dāng)?shù)南噭┫癁樾〖?xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞；

2)將iPS/ES細(xì)胞按1×10⁵/ml到2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移到非組織處理的培養(yǎng)容器中；

3)將培養(yǎng)容器放于二氧化碳培養(yǎng)箱中，20rpm到200rpm水平搖動(dòng)培養(yǎng)8-120小時(shí)；

4)利用雙面濾網(wǎng)過(guò)濾培養(yǎng)物，去除游離、死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片，收集聚合細(xì)胞球體，并將集合細(xì)胞球體重懸于分化培養(yǎng)基中；

5)聚合細(xì)胞球體繼續(xù)培養(yǎng)形成擬胚體。

優(yōu)選，接種的細(xì)胞濃度為5×10⁵/mL。

所述培養(yǎng)基為所有適合iPS/ES細(xì)胞維持干性或分化的培養(yǎng)基。

優(yōu)選，所述水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)的速度為70rpm。

優(yōu)選，所述水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)。