[發明專利]一種鈣依賴型耐熱α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的編碼基因、制備技術和應用

有效

• 申請號: 202010047484.0
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111117986B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 龍良鯤;林群英;孫璐;丁少軍
• 申請（專利權）人: 南京林業大學;中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/80;C12P19/14;C12P19/12;C12P19/02;C12P19/00;C12N15/11
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本發明提供了一種來源于微細正青霉的鈣依賴型耐熱α?L?阿拉伯呋喃糖苷酶，其氨基酸序列和核酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。該阿拉伯呋喃糖苷酶基因在瑞氏木霉中重組表達，獲得的純酶(EpABF62C)分子量為33 kDa。EpABF62C具廣泛的催化活性，最適溫度為65℃、最適pH為4.5，其熱穩定性依賴于Ca²⁺，在55℃下穩定5天，在pH2.0?11.0下穩定，比酶活達205.24U/mg。阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C能協同木聚糖酶高效降解小麥阿拉伯木聚糖，制備低聚糖和單糖。該發明在功能食品、醫藥保健和生物能源等領域具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種鈣依賴型耐熱α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C及其編碼基因，制備技術和應用。

背景技術

植物半纖維素是地球上儲量僅次于纖維素的生物質資源。木聚糖是半纖維素的重要成分，常見于闊葉木及禾本科植物的細胞壁，是一種復雜的多聚五碳糖。木聚糖的木糖基主鏈上通常含有阿拉伯糖側鏈分支，尤其是谷物麩皮來源的木聚糖的阿拉伯糖側鏈含量高達38-45%。木聚糖主鏈的降解主要由糖苷水解酶（GH）家族10和11中內切型木聚糖酶完成。研究數據顯示，木糖殘基上的阿拉伯糖取代基對木聚糖主鏈的降解形成阻礙作用，去除阿拉伯糖側鏈基團是高效降解木聚糖的前提。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(alpha-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55)是能夠催化水解阿拉伯木聚糖或阿拉伯聚糖等高分子上的阿拉伯糖殘基非還原端，釋放出阿拉伯糖分子的一類酶的總稱。在碳水化合物活性酶數據庫（http://www.cazy.org/）中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分布于糖苷水解酶（GH）家族GH2、3、43、51、54和62家族，不同家族的酶具有差別性的作用特點。例如，GH62家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有更高的底物專一性，僅表現出對天然阿拉伯木聚糖的高催化活性。

工業上，以α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶去除木聚糖的阿拉伯糖取代基，進而木聚糖酶作用于木糖殘基間的連接鍵，能夠獲得木二糖、木三糖等低聚木糖和木糖分子。阿拉伯糖、木糖和低聚木糖具有多種生物活性和功能，已廣泛用于醫藥保健、食品、飼料和生物煉制等領域。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶成為具有重要利用價值的工業用酶資源。耐熱酶常具有高的最適催化溫度、高的比活性和高的熱穩定性，容易實現高效催化和循環利用的目的，在工業應用中備受青睞。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的耐熱性已成為評價其應用價值的重要指標之一。

當前，不同來源和類型的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶已有研究報道，但同時具有催化效率高、生產成本低和循環使用等特性，符合市場需求的產品仍然不足。因此，挖掘新穎的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，實現高效率及低成本的制備工藝，明確其酶學特性及工業應用條件，是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶資源產業化利用的有效手段。

發明內容

發明目的：針對現有市場耐熱α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶制劑產品的不足，本發明的目的是提供一種來源于微細正青霉4-14中的鈣依賴型耐熱α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，使其具有高效的催化能力、良好的熱穩定性和pH穩定性。本發明的另一目的是提供上述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的制備技術和應用。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種鈣依賴型耐熱α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

經蛋白同源性比對發現α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C屬于糖苷水解酶家族62成員。其最適pH為4.5，最適溫度為65℃，pH穩定性好；鈣離子對于該酶的熱穩定性具有關鍵作用，在存在鈣的情況下，其在55 ℃下能穩定5天，50℃下能穩定至少7天；該酶對阿拉伯木聚糖的比活性高，對黑麥阿拉伯木聚糖的比活性高達205.24 U/mg。