[發(fā)明專利]一種基于實時熒光定量PCR檢測鴨星狀病毒3型用引物探針組、試劑盒及檢測方法

有效

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• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111041128B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設計）人: 傅光華;黃瑜;傅秋玲;程龍飛;施少華;萬春和;陳紅梅;劉榮昌;林建生
• 申請（專利權）人: 福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

本發(fā)明提供了一種基于實時熒光定量PCR檢測鴨星狀病毒3型用引物探針組，包括引物和探針、試劑盒及檢測方法，涉及生物技術領域。本發(fā)明提供的引物和探針適用于熒光定量PCR擴增，并且準確地從鴨甲肝病毒、禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒和鴨細小病毒中鑒別出鴨星狀病毒3型，特異性達100％。本發(fā)明還提供了一種基于實時熒光定量PCR檢測鴨星狀病毒3型的試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒方便準確地鑒定出鴨星狀病毒3型的存在，操作簡便，靈敏度高，檢測限達21.3個拷貝，檢測的組內變異系數(shù)為0.58～2.21％，組間變異系數(shù)0.68～2.53％重復性好。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于實時熒光定量PCR檢測鴨星狀病毒3型用引物探針組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

鴨星狀病毒(Duck astrovirus，DAstV)是引起鴨病毒性肝炎的重要病原之一，為星狀病毒科(astroviridae)禽星狀病毒屬(Avastrovirus)的成員，包括鴨星狀病毒1型(DAstV-1)，鴨星狀病毒2型(DAstV-2)及鴨星狀病毒3 型(DAstV-3)。DAstV為無囊膜病毒，基因組為單股正鏈RNA、全長約7.4kb，包含3個主要的開放閱讀框(ORFs)(ORF1a、ORF1b、ORF2)，編碼病毒的兩個非結構蛋白nsp1a、nsp1b，RNA依賴的RNA聚合酶(RDRP)及病毒的衣殼蛋白等，病毒基因組的5′端和3′端為非編碼區(qū)，5′端非編碼區(qū)長為19 nt，含有CCGAA基序，3′端非編碼區(qū)為219nt，含有星狀病毒共有序列s2m 基序，3′末端為poly(A)尾。

DAstV-1最早由Norfolk于1965年在英國的鴨肝炎病例中發(fā)現(xiàn)，當時被命名為血清2型鴨肝炎病毒(DHV-2)，隨后于2005年被更名為DAstV-1。 2009年Todd等傳統(tǒng)的血清3型鴨肝炎病毒(DHV-3)歸為星狀病毒屬的成員，有學者鑒于其與DAstV-1M52株的序列同源性僅為64％-69％之間，建議將其暫定為DAstV-2。DAstV-3是近來在鴨群中發(fā)現(xiàn)的新型星狀病毒，其確切的分類地位尚不明確，據(jù)該病毒基因序列與DAstV-1及DAstV-2同源性均較低，學者建議另外設立為DAstV-3。3種DAstV間的抗原性和基因組序列同源性差異比較明顯。

鴨星狀病毒感染可引起鴨發(fā)生病毒性肝炎，病雛鴨常呈現(xiàn)角弓反張、肝臟出血充血、腎臟腫大，鴨群病死率可達50％以上。近年來，盡管養(yǎng)鴨產業(yè)不斷升級，集約化、規(guī)模化程度越來越高，鴨病毒性肝炎依然是嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。Liao和劉寧等多個研究團隊分別在江西、廣東、山西、北京、內蒙、安徽和山東等地開展DAstV-3流行病學調查，表明在不同品種、日齡的鴨糞樣中均檢測到該病毒核酸，陽性率30％-83.9％，即成年鴨是DAstV-3帶毒者，并通過消化道途徑向外排毒；在孵化過程中死亡的胚蛋及新生雛鴨也檢測到不同程度的DAstV-3感染，提示該病毒可能經卵垂直傳播，是引起鴨胚死亡的原因之一。

實時熒光定量PCR是一種通過測定熒光信號強度來達到對樣品中目的基因含量進行檢測的方法，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具。該方法在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。

我國鴨群鴨星狀病毒DAstV-3感染的分布范圍較廣，對養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展影響大，當前國內外主要采用病毒分離及常規(guī)PCR方法檢測鴨星狀病毒 DAstV-3，尚未見能夠實時定量的熒光定量的引物、探針及其應用方法相關研究報道。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于實時熒光定量PCR檢測鴨星狀病毒3型用引物探針組、試劑盒及檢測方法。本發(fā)明提供的方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好和快速的特點。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：