[發(fā)明專利]一種檢測角蛋白酶活力的酶譜方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010046593.0
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111206070B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳璐;孫懷強
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N27/447
• 代理公司: 成都帝鵬知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51265
• 代理人: 李華

1.一種檢測角蛋白酶活力的酶譜方法，其包括：

1)角蛋白底物預(yù)處理，清除羽毛角蛋白上的雜質(zhì)；

2)角蛋白膠譜的制備，包括制備分離膠和濃縮膠；

3)進行電泳和水解條帶顯色；

其特征在于：

(A)步驟1)中，將10g角蛋白底物和500ml有機溶劑加入回流冷凝裝置中，于80-100℃消煮60-100min；用兩倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的丙酮沉淀角蛋白；離心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干，將角蛋白沉淀晾干后，再進行研磨，過100目篩；

(B)在制備分離膠時，加入由(A)處理所得角蛋白底物，使得其質(zhì)量百分含量為0.1％，然后于室溫下以100r/min的速度攪拌1h，離心取上清，進行配置質(zhì)量濃度為12％的分離膠；配置所述質(zhì)量濃度為12％的分離膠時，其方法為：依次加入ddH₂O 3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/L pH＝8.8的Tris溶液2.5ml，10％SDS 50ul，再加入經(jīng)(A)處理所得角蛋白底物0.05-0.1g，于室溫下以100r/min的速度攪拌1h，然后將溶液在2000g離心15min，取上清，按10ml分離膠中加入10％過硫酸銨100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的體積比例制備成混合溶液；

(C)在電泳時，酶樣品按體積比1:3與上樣緩沖液混合；按5-10ul/孔混合樣品上樣，于4℃條件下，進行SDS-PAGE電泳，80-100V恒壓跑至分離膠和濃縮膠交界處后改為170-200V恒壓，直至溴酚藍跑出膠外；所述上樣緩沖液的成分為：0.32％Tris-HCl 6.4ml，4％pH7.2SDS8ml，16％甘油3.2ml，溴酚藍0.024g，ddH₂O 2.4ml；

所述角蛋白底物包括羽毛；所述有機溶劑包括二甲基亞砜、乙二醇中的一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用丙酮沉淀角蛋白后，于2000g離心15min收集角蛋白沉淀，用去離子水重懸，清洗沉淀，于2000g離心15min收集沉淀，重復(fù)清洗一次后于4℃晾干。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑為乙二醇。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，每次20-40min；然后，用漂洗液漂洗2次，每次10-20min；接著，將凝膠置于孵育液中37℃孵育24-40h；孵育結(jié)束后經(jīng)染色液于室溫染色2-4h或于4℃染色過夜；最后，用脫色液A和脫色液B分別脫色0.5-1h和1-2h；

所述脫色液A由甲醇、乙酸、去離子水按體積比3:1:6組成；

所述脫色液B由甲醇、乙酸、去離子水按體積比2:1:8組成。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗脫液為：2.5％Triton X-100，50mMTris-HCl，5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，pH7.6；所述漂洗液為：50mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，1μMZnCl₂，pH7.6；所述染色液為：0.05％考馬斯亮藍，甲醇30ml，乙酸10ml，ddH₂O 60ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述孵育液為下述孵育液中的一種：

1)50mM Tris-HCl，5mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，0.02％NaN₃，0.05％Brij-35，pH 7.6；

2)0.1M檸檬酸48.5ml，0.2M NaHPO₄ 51.5ml，pH 5.0；

3)50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl₂，0.02％NaN₃，pH 7.5。