[發明專利]一種測定水質中大腸桿菌含量的方法

在審

• 申請號: 202010045385.9
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111337470A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 白向茹;王利華;肖康飛;韓艷云
• 申請（專利權）人: 武漢市農業科學院
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;C12N1/20;C12N1/02;C12R1/19
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

1.一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)銀-大腸桿菌體系的制備

將一定體積的菌液在一定轉速和時間下，離心一次，除去上清液，然后加入一定體積的AgNO₃溶液，渦旋后，引入還原劑，所述混合溶液變為墨綠色，即得銀-大腸桿菌體系，并將所述混合溶液避光置于3-4℃冰箱保存備用；

(2)捕獲探針的制備

取一定體積、粒徑的羧基磁珠，磁力作用下水洗三次，將其置于醋酸鈉緩沖液中，向其中加入定量EDC溶液進行羧基活化，加入大腸桿菌單克隆抗體，使大腸桿菌單克隆抗體連接在磁珠表面，磁力作用下水洗三次，即得捕獲探針，置于3-4℃冰箱保存備用；

取一定體積所述捕獲探針，加入到步驟(1)所述銀-大腸桿菌體系中，室溫條件下，將其搖床振蕩孵育30-32分鐘，磁力作用分離，得到銀-大腸桿菌-磁珠體系；

(3)加入硝酸

在步驟(2)所述銀-大腸桿菌-磁珠體系中加入一定體積的稀硝酸，并在磁力作用下，分離得到上清液，將所述上清液置于EP管中；

(4)檢測探針的制備

采用具有增強效應的基底材料作為拉曼信號的增強基底，將帶巰基且位于生物靜默區的信號分子自組裝于增強基底表面，即得檢測探針，并將其置于3-4℃冰箱保存備用；

(5)大腸桿菌檢測標準工作曲線的建立

配置不同濃度的大腸桿菌菌液，與所述捕獲探針混合，并在磁力作用下分離，取適量上清液，加入稀硝酸得混合溶液，然后將所述混合溶液加入到所述檢測探針中，靜置10-12min后，校準拉曼光譜儀，進行拉曼測試，建立大腸桿菌濃度x與MBN信號分子在2228cm^-1處的峰強度y的標準工作曲線；

(6)水質中大腸桿菌含量的測定

將待測水樣簡單前處理后，進行磁力作用分離，取適量上清液經稀硝酸分解后加入所述檢測探針中，靜置10-12min，進行拉曼測試，得到MBN信號分子在2228cm^-1處的峰強度，將所述峰強度與步驟(5)中建立的標準工作曲線進行對比，確定待測實際樣品中大腸桿菌的含量。

2.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(1)中AgNO₃溶液濃度為10mM-100mM。

3.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(1)中還原劑包括鹽酸羥胺在內的可將AgNO₃還原為銀納米粒子的所有試劑。

4.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)中羧基磁珠粒徑為380nm-1μm。

5.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(2)中醋酸鈉緩沖液濃度為10mM-80mM，pH為5-7。

6.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(3)中稀硝酸濃度為10mM-60mM。

7.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(4)中具有增強效應的基底材料包括20-500nm不同粒徑的金納米球、金納米星、金納米花及銀納米材料。

8.根據權利要求1所述的一種測定水質中大腸桿菌含量的方法，其特征在于，所述步驟(4)中生物靜默區信號分子，除了對巰基苯甲腈外，還包括其他一切帶巰基且拉曼位置在靜默區的分子。