[發明專利]一種高效的提取毛干中DNA的方法

有效

• 申請號: 202010044705.9
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111154751B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發明（設計）人: 徐艷春;周永恒;楊淑慧
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種高效的提取毛干中DNA的方法，其特征在于，步驟如下：

一、毛干的前處理：

將毛干置于酒精中浸泡5min～10min后蒸干，然后與質量分數1％-2％的SDS溶液混合，60℃～65℃條件下加熱30min～40min；取出毛干清洗后，再將毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃～70℃浸泡15s～35s，取出清洗后，用酒精浸泡5min～10min；

二、毛干的消化：

將經過前處理后的毛干置于處理液中，56℃消化3h～4h，然后再加入PK溶液消化1h，再加入EDTA溶液56℃溫育30min～40min，得到毛干消化液；所述處理液由消化液A、PK溶液、SDS溶液和DTT溶液配制而成，所述消化液A為含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L Ca²⁺和100mmol/LNaCl的水溶液；

三、消化液提純：

1)將步驟二得到的毛干消化液與氯仿溶液按照1:1的體積比混合后靜置3min～4min，然后離心，取上清；

2)向上清液中加入等體積異丙醇，混勻后加入磁珠，靜置3min～4min，然后進行磁分離，棄廢液；

3)然后，利用漂洗液A對磁珠進行漂洗，棄廢液；所述漂洗液A為異丙醇和TE的混合液，pH＝8；如步驟2)中上清液無色，則不需要步驟3)；

4)然后，利用體積分數為70％～75％乙醇對磁珠進行漂洗，棄廢液；

5)然后，將磁珠離心后進行磁分離，棄廢液，晾干磁珠，去除乙醇；

6)再將磁珠與洗脫液混合，56℃加熱10min～15min，離心后進行磁分離，得到的上清液即為毛干DNA。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一中所述酒精體積濃度為95％。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一中所述毛干與SDS溶液的用量比為：(1-10)mg:750μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一中將毛干與質量分數1％的SDS溶液混合，溫度為65℃條件下加熱30min；取出毛干清洗后，再將毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃浸泡20s。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二中所述毛干的消化，具體為：每1mg～10mg毛干中加入消化液A 335μL，10mg/ml的PK溶液50μL，質量分數為15％的SDS溶液40μL，體積分數為15.4％的DTT溶液50μL，56℃消化3h后，再加入30μL 10mg/ml的PK溶液，繼續消化1h，再加入0.5mol/L的EDTA溶液25μL，56℃消化30min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三所述消化液提純中，步驟1)中所述離心為12000rpm離心5min～10min。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三中所述漂洗液A中異丙醇的體積分數為30％～35％。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三中所述晾干為室溫晾干5min～10min。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三所述磁珠與洗脫液混合后，56℃加熱15min。