[發(fā)明專利]多光子熒光顯微成像系統(tǒng)及成像方法

有效

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• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111175263B
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發(fā)明（設計）人: 溫維佳;婁凱
• 申請（專利權）人: 廣州市凱佳光學科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 石家莊旭昌知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 13126
• 代理人: 張會強

本發(fā)明提供了一種多光子熒光顯微成像系統(tǒng)，其包括可調諧飛秒激光器，以及沿所述可調諧飛秒激光器的激光輸出光路依次布置的脈沖壓縮器、擴束器、方向調節(jié)單元、光束轉換單元、共振掃描振鏡、聚焦單元，以及空間色散單元、聚光單元，和反射單元；還包括位于所述反射單元一側的可搭載待測樣品的樣品臺，位于所述樣品臺和所述反射單元之間的顯微物鏡，以及相對于所述樣品臺位于所述反射單元另一側的圖像采集單元，和分別與所述可調諧飛秒激光器、所述共振掃描振鏡、所述圖像采集單元相連的控制器。本發(fā)明也提供了基于以上成像系統(tǒng)的成像方法，且本發(fā)明的成像系統(tǒng)可時空聚焦結合進行實現快速成像，并能夠提高分辨率以及有效抑制成像畸變。

技術領域

本發(fā)明涉及熒光顯微成像技術領域，特別涉及一種新型時空聚焦的多光子熒光顯微成像系統(tǒng)，同時本發(fā)明也涉及有基于該系統(tǒng)的多光子熒光顯微成像方法。

背景技術

熒光顯微成像技術作為生物醫(yī)學領域必不可少的觀察手段已經得到廣泛的應用和普遍的認可。目前，常用的熒光顯微成像技術是單光子激光掃描共聚焦顯微鏡，其通過光聚焦的點激發(fā)并使用針孔濾除焦域以外的光信號對成像的影響，從而有效提高分辨率和信噪比。不過，單光子熒光顯微成像所采用的光激發(fā)波長主要在可見光段范圍(405nm-647nm)，生物樣品對可見光波段吸收較高，光散射高從而限制單光子顯微成像技術在生物成像，尤其是在深層、高分辨率成像領域的應用。

相比單光子顯微成像技術，多光子顯微成像使用近紅外波長光作為激發(fā)光源，可有效降低光毒性和光漂白等因素的影響，并可以更精確的穿透和定位深層熒光探針。但是，雖然多光子結合激光掃描共聚焦顯微成像技術可以觀測的更深，可由于生物組織折射率分布較復雜，成像畸變仍然是該類技術面臨的重大難題。而且現有的激光掃描共聚焦顯微技術普遍存在結構復雜、操作不便、成像速度慢以及分辨率低等問題，仍難以滿足對生物組織等渾濁樣品深層成像的需求。

作為一種新的顯微成像方式，時聚焦多光子熒光顯微成像技術自本世紀被提出后，其已被證明可有效去除成像畸變，不過這種成像方法也存在需要單脈沖能量高的飛秒激光、儀器成本高，以及對樣品的光損傷大，光照明不均勻和縱向分辨率低等問題。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種多光子熒光顯微成像系統(tǒng)，以可實現快速成像，并能夠提高分辨率以及有效抑制成像畸變。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現的：

一種多光子熒光顯微成像系統(tǒng)，其包括可調諧飛秒激光器，以及沿所述可調諧飛秒激光器的激光輸出光路依次布置的脈沖壓縮器、擴束器、改變所述激光線偏振方向的方向調節(jié)單元、將所述激光轉換為一維平頂光束的光束轉換單元、對轉換后的一維平頂光束進行一維掃描的共振掃描振鏡、對掃描后的光束進行一維聚焦以形成線型光束的聚焦單元，以及對所述線型光束進行頻譜成分空間分離的空間色散單元、匯集空間分離的光束各頻譜成分的聚光單元，和位于所述聚光單元之后的可反射匯集后光束的反射單元；

且所述多光子熒光顯微成像系統(tǒng)還包括位于所述反射單元一側的可搭載待測樣品的樣品臺，位于所述樣品臺和所述反射單元之間的顯微物鏡，以及相對于所述樣品臺位于所述反射單元另一側的圖像采集單元，和分別與所述可調諧飛秒激光器、所述共振掃描振鏡、所述圖像采集單元相連的控制器；其中，所述反射單元反射匯集后的光束以經所述顯微物鏡射向所述樣品臺，且所述反射單元亦設置為可透射所述樣品臺處出射的熒光，而供所述圖像采集單元采集。

進一步的，于所述可調諧飛秒激光器和所述脈沖壓縮單元之間設有可通斷所述激光輸出的光闌單元。

進一步的，所述光闌單元采用電控孔徑光闌。

進一步的，所述可調諧飛秒激光器輸出的脈沖激光的中心波長在700-1000nm之間，重復頻率80MHz、脈沖寬度150fs，且激光單脈沖能量為13-40nJ。

進一步的，所述可調諧飛秒激光器輸出激光光譜帶寬在7nm-22nm范圍內可調。