[發明專利]一種重組蛋白的分離純化方法

有效

• 申請號: 202010043094.6
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN113121637B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 張貴民;朱梅梅;柳常青;劉忠
• 申請（專利權）人: 魯南制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C12N15/70
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• 代理人: 暫無信息

1.一種重組蛋白的分離純化方法，其特征在于，它包括如下內容：將含目的重組蛋白的發酵液，離心得濕菌體，經破菌、洗滌和復性初級純化處理，然后進行如下步驟：

A.超濾：將初級純化樣品，經裝有切向流膜的過濾器過濾，得濾液，即為含目的蛋白的過濾樣品；

B.使用胰蛋白酶對步驟A所得的含目的蛋白的過濾樣品進行酶切，得酶切液；

C.反相層析：稀釋步驟B所得的酶切液，過濾，并裝載至反相層析柱上，用平衡液沖洗層析柱至基線吸光度，梯度洗脫，收集含目的重組蛋白的流出液；

D.反相層析：反相層析樹脂柱裝柱平衡后，裝載步驟C所得的含目的重組蛋白的流出液，用平衡緩沖液洗滌層析柱至基線吸光度，洗脫液洗脫，收集含目的重組蛋白的流出液；

E.除熱原：反相層析樹脂裝柱平衡后，裝載步驟D所得的含目的重組蛋白的流出液，用平衡液平衡至基線吸光度，洗脫液洗脫，收集含目的重組蛋白的流出液；F.超濾和裝瓶：將步驟E所得的含重組蛋白的流出液，經裝有切向流膜的過濾器超濾濃縮，收集濾液，即為目的重組蛋白；

其中步驟C中所述的梯度洗脫液為A相和B相組成，其中A相為10～40mM檸檬酸三鈉或乙酸鈉、80～350mM氯化鈉或氯化鉀與10～20％(V/V)異丙醇的混合溶液，B相為10～40mM檸檬酸三鈉或乙酸鈉、40～180mM氯化鈉或氯化鉀與40～50％(V/V)異丙醇的混合溶液；

步驟D中所述的梯度洗脫液為A相和B相組成，其中A相為5～20mM檸檬酸三鈉、90～200mM硫酸銨和5～20％(V/V)乙腈的混合溶液，B相為5～20mM檸檬酸三鈉、20～80mM硫酸銨和30～80％(V/V)乙腈的混合溶液；

步驟E中所述的洗脫液為0.1～0.5M氯化鈉或氯化鉀、20～30mM的檸檬酸三鈉或乙酸銨溶液和35％-80％(V/V)的乙腈或異丙醇溶液；

所述重組蛋白為甘精胰島素；步驟A中所述的切向流膜為再生纖維素膜或聚醚砜膜；步驟C、D、E中洗脫液的pH為3~4；步驟F中所述的切向流膜為PLC6C-C或PLCGC-C。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A中所述的切向流膜的截留分子量為10～300KD。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中所述的胰蛋白酶為牛胰蛋白酶或豬胰蛋白酶，胰蛋白酶與胰島素前體的質量比為1∶400～900mg/mg。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中所述的反相層析的填料為SourceRPC。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟C中所述的反相層析的填料為Source15RPC或Source 30RPC。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟D中所述的反相層析的填料為C8。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟D中所述的反相層析的填料為UniInsulin C8 type B、Unisil 10-120C8Ultra或Daiso SP-200-C8-10-BIO。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟E中所述的反相層析填料為SourceRPC。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟E中所述的反相層析填料為Source30RPC或Source 15RPC。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟F中所述的切向流膜的截留分子量為5～50KD。