[發明專利]一種液質聯用檢測可溶性環氧化物水解酶的方法

有效

• 申請號: 202010042707.4
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111189940B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 許美娟;陳影;姜超;襲曉昀;吳婷;吳堅;張倩;儲繼紅;居文政;戴國梁
• 申請（專利權）人: 江蘇省中醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/54;G01N30/60;G01N30/72
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種液質聯用檢測可溶性環氧化物水解酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）從組織中篩選可溶性環氧化物水解酶的特異性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；以特異性多肽為標準品，利用質譜同位素內標定量法，通過液質聯用的方法進行檢測，以標準品的濃度為橫坐標，定量子離子峰面積與同位素內標峰面積的比值作為縱坐標，建立標準曲線；

（2）通過液質聯用的方法測定樣品中特異性多肽的濃度，再轉換計算得到樣品中可溶性環氧化物水解酶的濃度；

其中，液質聯用的具體色譜條件如下：

（1）液相色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18，4.6×100 mm，1.8 μm；保護柱：Agilent ZORAX SB-C18，2.1×12.5 mm，5 μm；流動相：A：B= 0.1% v/v甲酸水溶液：乙腈，梯度洗脫；柱溫：40 ℃；

（2）質譜條件

采用AB公司API 4000 MS/MS質譜儀進行化合物檢測，采用ESI離子源、正離子MRM模式檢測，離子源參數如下：CAD：12；CUR：20；GS1：40；GS2：60；IS：5500；TEM：500；EP：10；CXP：9；

。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的組織為大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、胃、肌肉、脂肪、卵巢、睪丸、胎盤和血管中的任意一種。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，特異性多肽的篩選方法為向0.4 g組織中加入1 mL水勻漿后，于9000 g 4℃離心20min，取上清，即S9樣品；測定S9樣品的蛋白濃度；對S9樣品進行酶法消化；對消化后的S9樣品進行液質聯用檢測，篩選，即得特異性多肽。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酶法消化為向160 μg S9樣品中加入10 μL 250 mM 的二硫蘇糖醇水溶液和40 μL 100 mM的碳酸氫銨緩沖液，95℃滅活10min，然后加入20 μL 500 mM的1H-吲哚-3-羧酸（吲哚乙酸）水溶液，避光孵育30 min后，加入甲醇500 μL和去離子水400 μL，然后16000 g 4℃離心5 min，移去上層液體后加入60 μL碳酸氫銨緩沖液和20 μL濃度為160 μg·mL^-1胰蛋白酶碳酸氫銨水溶液于37℃消化16 h后，加入20 μL內標工作液和10 μL稀釋液，于12000 g 4℃離心10 min，取上清液，即為消化后的S9樣品。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的內標工作液為SEQ ID NO.1所示的特異性多肽的同位素多肽，其濃度為200 ng·mL^-1。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的內標工作液的制備方法包括如下步驟：

（i）用稀釋液將4 μL 2.5 mg·mL^-1的內標多肽儲備液稀釋至1 mL，得到10 μg·mL^-1的內標稀釋液；

（ii）用稀釋液將20μL 10μg·mL^-1的內標稀釋液稀釋至1 mL，即得200 ng·mL^-1的內標工作液。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，測定S9樣品的蛋白濃度的方法為BCA法。