[發(fā)明專(zhuān)利]一種重組甲基營(yíng)養(yǎng)菌和口服疫苗

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010041113.1
• 申請(qǐng)日: 2020-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111139210A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳師勇;楊松;馬宏姝;于寧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12N15/66;A61K39/02;A61P37/04;C12R1/01;C12R1/26
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 呂紀(jì)濤

1.一種重組甲基營(yíng)養(yǎng)菌，其特征在于，將pSCM15質(zhì)粒和pSCM16質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到甲基營(yíng)養(yǎng)菌中，得到重組甲基營(yíng)養(yǎng)菌；

所述pSCM15質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述pSCM16質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組甲基營(yíng)養(yǎng)菌，其特征在于，所述甲基營(yíng)養(yǎng)菌包括Methylomonas、Methylobacter、Methylococcus、Methylosinus、Methylocyctis、Methylomicrobium、Methanomonas、Methylophilus、Methylobacillus和Methylobacterium屬中的任一種菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組甲基營(yíng)養(yǎng)菌，其特征在于，所述甲基營(yíng)養(yǎng)菌為扭脫甲基桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組甲基營(yíng)養(yǎng)菌，其特征在于，所述pSCM15質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)提取甲基營(yíng)養(yǎng)菌的基因組，PCR擴(kuò)增得到celup基因片段和celdown基因片段，將所述celup基因片段和celdown基因片段連接，得到celup-celdown基因片段；

所述celup基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述celdown基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

2)將所述步驟1)得到的celup-celdown基因片段和pCM433質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，酶切后通過(guò)酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，得到具有cel同源片段的載體；

3)提取遲緩愛(ài)德華氏菌的基因組，PCR擴(kuò)增得到flg基因片段，將所述flg基因片段與Pmax啟動(dòng)子連接，得到Pmax-flg基因片段，以所述步驟2)得到的具有cel同源片段的載體為模板擴(kuò)增得到celup-pCM433載體-celdown基因片段，將所述celup-pCM433載體-celdown基因片段和Pmax-flg基因片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子得到具有celup-Pmax-flg-celdown的單拷貝抗原表達(dá)載體；

所述flg基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Pmax啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

4)將所述步驟3)得到的flg基因片段與XhoI酶切位點(diǎn)、RBS序列連接，得到XhoI-RBS-flg片段，以所述步驟3)得到的具有celup-Pmax-flg-celdown的單拷貝抗原表達(dá)載體為模板擴(kuò)增得到Pmax-flg-celup-載體-celdown片段，將所述Pmax-flg-celup-載體-celdown片段與XhoI-RBS-flg片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，得到具有celup-Pmax-flg-XhoI-RBS-flg-celdown的雙拷貝flg抗原表達(dá)載體；

5)將所述步驟3)得到的flg基因片段與XhoI酶切位點(diǎn)、RBS序列、BstBI酶切位點(diǎn)連接，得到XhoI-RBS-flg-BstBI片段，用XhoI酶酶切步驟4)得到的雙拷貝flg抗原表達(dá)載體，酶切后與XhoI-RBS-flg-BstBI片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，得到具有celup-Pmax-flg-XhoI-RBS-flg-BstBI-RBS-flg-celdown的三拷貝抗原表達(dá)載體；

6)以所述步驟5)得到的三拷貝抗原表達(dá)載體為模板擴(kuò)增得到具有兩個(gè)拷貝flg的XhoI-RBS-flg-BstBI-RBS-flg基因片段，引入XhoI酶切位點(diǎn)，得到XhoI-RBS-flg-BstBI-RBS-flg-XhoI基因片段，對(duì)所述XhoI-RBS-flg-BstBI-RBS-flg-XhoI基因片段進(jìn)行XhoI酶切，得到酶切片段，用XhoI酶酶切步驟5)得到的三拷貝抗原表達(dá)載體，得到酶切載體，將所述酶切片段和酶切載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，得到pSCM15質(zhì)粒。