[發明專利]一種含有低溫和QS雙重誘導型啟動子的表達載體及其應用

有效

• 申請號: 202010039161.7
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111893127B
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發明（設計）人: 王彥波;傅玲琳;王飛飛;周瑾茹;陳劍
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/78;C12N1/21;C12N15/31;C12R1/19;C12R1/39
• 代理公司: 杭州創造力專利代理事務所(普通合伙) 33332
• 代理人: 陳沖

本發明公開了一種含有低溫和QS雙重誘導型啟動子的表達載體及其應用，一種含有低溫和QS雙重誘導型啟動子的表達載體，所述啟動子的堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本發明所述的表達載體能夠在低溫和信號分子誘導下啟動低細胞密度的宿主細胞表達大量外源目的蛋白。本發明提供的低溫和QS雙重誘導型啟動子，使蛋白表達可控化，不僅可以應用于食品、醫學等領域相關蛋白的生產，還為研究特定蛋白的生物學功能提供新方法。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種含有低溫和QS雙重誘導型啟動子的表達載體及其應用。

技術背景

啟動子(Promoters)是位于結構基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA進行準確結合并具有轉錄起始的特異性，控制基因表達的起始時間和表達強度。啟動子一般是含有順式作用元件的一段DNA序列，其在基因的表達調控中起著關鍵作用：決定下游基因轉錄的特異性、方向和效率。此外，啟動子在構建能夠高水平表達異源表達載體的過程中起到關鍵作用，它決定了外源基因表達的時空順序、表達強度、轉錄效率和基因的表達水平。所以，研究啟動子的功能對于基因表達調控機制和日漸成熟的基因工程具有非常重要的科學意義。

通過對多種基因啟動子區的分析發現，絕大多數功能蛋白基因的啟動子都具有共同的結構模式，一般由啟動子核心元件和上游元件組成。比如在某些植物功能啟動子中，位于轉錄起始位點上游-20～-30bp處的TATAbox為啟動子的核心元件，是富含有AT的保守序列區，與DNA(脫氧核糖核酸)雙鏈的解鏈有關，并決定轉錄起始點的選擇，是絕大多數植物啟動子正確表達所必需的。TATA box上游的保守序列稱為啟動子上游元件，包括-75bp處的CAAT box和-80～-110bp附近的GC box等一般上游啟動子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸類物質應答元件(JRE)、乙烯響應元件(ERE)等元件(張春曉,王文棋,蔣湘寧,等.植物基因啟動子研究進展[J].遺傳學報,2004,31(12):1455-1464；路靜,趙華燕,何奕昆,等.高等植物啟動子及其應用研究進展[J].自然科學進展,2004,8:002.)。其中，CAAT box是比較保守的序列，與RNA(核糖核酸)聚合酶的識別和結合有關，對基因轉錄具有較強的激活作用。只要具有了這些保守的結構框，那么就可以具有響應的啟動下游基因表達的功能。

誘導型啟動子(Inducible Promoter)是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，可以顯著地提高基因的轉錄水平。目前，針對誘導性啟動子的研究雖然有一些涉及，但是還不是非常成熟，在一些物種和微生物中的相關研究也不是非常多，仍有進一步開發的空間。

低溫誘導型(Low-Temperature-Inducible)啟動子，是指在低溫刺激下，可以大幅度提高基因轉錄水平的一種啟動子。低溫表達體系能大大降低蛋白包涵體的形成，還能夠顯著提高異源蛋白的穩定性，尤其是一些熱敏蛋白。群體感應(Quorum Sensing)是細菌細胞間信息傳遞的普遍機制，細菌通過合成、分泌信號分子(又稱自誘導分子)來控制整個細菌群體行為，當信號分子濃度隨著細菌群體密度達到一定閾值時，即可啟動某些特定基因的大量表達，以調節細菌群體適應功能?，F有技術中已經有從丁香假單胞菌MB03中克隆得到了冰核基因inaQ啟動子，通過轉錄活性進行相對定量分析,通過分別在16℃和28℃培養條件下其生長階段的基因轉錄活性水平的比較,結果顯示該啟動子在16℃培養下冰核基因的轉錄水平明顯高于丁香假單胞菌的正常培養溫度28℃下的水平,在對數生長中后期前者是后者的將近兩倍,而到穩定期中期則達到接近6倍,并且在16℃下有利于冰核基因的持續轉錄表達(孟姍，丁香假單胞菌MB03冰核蛋白基因低溫依賴型啟動子轉錄活性的研究)，這充分的體現了低溫啟動子具有較好的低溫表達的優勢。