[發(fā)明專利]一種萊茵衣藻失穩(wěn)域基因、基于失穩(wěn)域的蛋白表達(dá)調(diào)控方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111153970B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈彬;胡章立;黃瑛;李欣怡;陳家穎
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類號: C07K14/405
• 分類號: C07K14/405;C12N15/31;C12N15/62;C12N1/13;C12N15/79
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種萊茵衣藻失穩(wěn)域基因、基于失穩(wěn)域的蛋白表達(dá)調(diào)控方法及其應(yīng)用，所述失穩(wěn)域基因包括突變型雷帕霉素結(jié)合蛋白基因和萊茵衣藻RBCS2內(nèi)含子1；所述失穩(wěn)域基因包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。本發(fā)明采用突變型雷帕霉素結(jié)合蛋白基因和萊茵衣藻RBCS2內(nèi)含子1構(gòu)建的失穩(wěn)域基因在萊茵衣藻細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物失穩(wěn)域蛋白極度不穩(wěn)定，可以被胞內(nèi)蛋白酶迅速降解，使得含失穩(wěn)域的融合蛋白被降解；而小分子誘導(dǎo)物Shield?1可以提高失穩(wěn)域的穩(wěn)定性，從而使融合蛋白穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了在萊茵衣藻中調(diào)控蛋白表達(dá)的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種萊茵衣藻失穩(wěn)域基因、基于失穩(wěn)域的蛋白表達(dá)調(diào)控方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

單細(xì)胞真核微藻萊茵衣藻被稱為“綠色酵母”或“光合酵母”，具有結(jié)構(gòu)特殊、容易培養(yǎng)、生長快速、遺傳背景清晰和容易轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，成為研究基因功能和表達(dá)外源基因的模式生物。萊茵衣藻具有核染色體、線粒體和葉綠體三套遺傳體系，且均能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(Boynton J E,Gillham N W,Harris E H,Hosler J P,Johnson A M,Jones A R,Randolph-Anderson B L,Robertson D,Klein T M,Shark K B,Et A.1988.Chloroplasttransformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.Science,240(4858):1534-1538)，是理想的轉(zhuǎn)基因植物受體和生物反應(yīng)器。目前已有多種蛋白在萊茵衣藻中成功表達(dá)，如丙型肝炎病毒融合抗原(張中林、山松、陳曦等，丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定點(diǎn)整合入衣藻葉綠體基因組的研究，遺傳HEREDITAS(Beijing)，1999，21：1-6)、綠色熒光蛋白(胡章立、王潮崗、吳錦霞，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在萊茵衣藻中的高效表達(dá)，深圳特區(qū)科技，2005，0：217-222)、人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL蛋白(楊宗岐、李鐵女、陳鳳等，人可溶性TRAIL蛋白在衣藻葉綠體中的表達(dá)，科學(xué)通報(bào)，2006，12(51)：1400-1405)、人白細(xì)胞介素4(趙雅坤、史賢明、張忠明，人白細(xì)胞介素4在衣藻葉綠體中的高效轉(zhuǎn)化及表達(dá)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(2)：110-116)等。因此，開展萊茵衣藻外源基因表達(dá)的研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

雖然已有將外源基因在萊茵衣藻中表達(dá)的報(bào)道，但是表達(dá)量難以控制，表達(dá)量通常較低甚至“基因沉默”，嚴(yán)重影響了對萊茵衣藻的深入研究。現(xiàn)階段萊茵衣藻中調(diào)控外源基因表達(dá)的手段有限，大多數(shù)利用強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行控制，屬于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。Banaszynski等在動(dòng)物細(xì)胞中建立了一種蛋白水平的調(diào)控方式(Banaszynski L A,Chen L,Maynard-SmithL A,Ooi A G L,Wandless T J.2006.A Rapid,Reversible,and Tunable Method toRegulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic SmallMolecules.Cell,126(5):995-1004)，這種調(diào)控方式的核心是失穩(wěn)域蛋白。失穩(wěn)域由肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶(FKBP12)突變而來，十分不穩(wěn)定、容易被細(xì)胞內(nèi)泛素途徑降解，造成含失穩(wěn)域的融合蛋白被降解；但是，當(dāng)環(huán)境中存在小分子誘導(dǎo)物Shield-1((S)-(R)-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1-(3-(2-morpholinoethoxy)phenyl)propyl1-((S)-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)butanoyl)piperidine-2-carboxylate)時(shí)，失穩(wěn)域蛋白穩(wěn)定存在從而使融合蛋白穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。通過失穩(wěn)域調(diào)控外源蛋白的表達(dá)快速而有效，已在動(dòng)物細(xì)胞中得到了廣泛應(yīng)用。

將上述調(diào)控方式應(yīng)用于萊茵衣藻，有利于調(diào)控外源蛋白在萊茵衣藻中的表達(dá)水平。

發(fā)明內(nèi)容