[發明專利]一種超氧化物歧化酶的純化方法

在審

• 申請號: 202010038360.6
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111019914A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 李瑾;尹大川;王媚;王露;趙鵬
• 申請（專利權）人: 陜西中醫藥大學;西安高德威爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 西安毅聯專利代理有限公司 61225
• 代理人: 楊燕珠

本發明提供了一種超氧化物歧化酶的純化方法，包括以下步驟：步驟一：取蚯蚓，使用清水對蚯蚓進行清洗，對蚯蚓進行吐泥處理；步驟二：將步驟一中的蚯蚓用組織搗碎勻漿機搗碎，經高速冷凍離心機離心分離，取離心液，即SOD提取液；步驟三：將SOD提取液進行不少于2次超濾，得到SOD純化液；步驟四：配置緩沖液，用緩沖液稀釋并配置濃度為2~100mg/ml的SOD溶液；步驟五：使用96種結晶試劑盒對步驟四中的SOD溶液進行結晶條件的篩選；步驟六：將步驟五中結晶試劑盒內的結晶溶液體系放置在20℃的溫控箱中，結晶6~8天，收集結晶的蛋白質晶體，并冷凍保存。本發明制備的SOD具有純度高，活性大的優點。

技術領域

本發明涉及超氧化物歧化酶技術領域，尤其涉及一種超氧化物歧化酶的純化方法。

背景技術

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase簡稱SOD)是一種新型酶制劑，是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內，如動物，植物，微生物等。

SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質，SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內的垃圾清道夫，廣泛應用于生物、醫藥、化工等領域。例如，SOD在治療腫瘤、炎癥和抗衰老等方面均有重要的臨床應用。研究人員發現，通過測定病人體內血清中的SOD活性的高低，可以對肺腫瘤病人疾病發展程度進行分析；可以將超氧化物歧化酶（SOD）制成制劑，作為陰莖纖維性海綿體炎疼痛期的治療藥物，具有安全、有效及相應的可控性；在自身性免疫病的治療方面也可發揮重要作用，如在治療紅斑狼瘡和系統性硬化病中，SOD能有效抑制病患者血清中的破壞因子，實現良好的治療效果。

雖然SOD擁有很好的抗氧化功能，具備廣闊的應用前景，但從天然物質中提取的SOD的濃度低而較難應用，使得其在實際應用中受到了一定的限制。同時，SOD屬于大分子的蛋白質，其以普通的狀態存在時其較難保持其生物活性的完整而導致失活，但是已結晶結構存在的蛋白質的活性較為穩定。

目前，蛋白質純化方法主要途徑包括分級鹽析、凝膠層析、膜分離等，而蛋白質結晶途徑則是一種較為傳統的方法。通過結晶方法可以得到純度、均一度、活性均極佳的蛋白質，是獲取最高品質蛋白質樣品的最佳途徑之一。由于結晶過程難度較大，工藝復雜，必須研發出穩定的結晶工藝才可以實現規模生產。在現有實際的SOD工業生產中，尚未實現SOD的結晶純化生產，亦尚未發展出具體的生產工藝。因此，如何提供一種純度高、結晶好、生物活性穩定、規模化生產的SOD是亟需解決的問題。

發明內容

本發明為解決現有技術中SOD的濃度低、穩定性差、極易失活、規模化生產程度低的問題，提供了一種超氧化物歧化酶的純化方法。

由于蚯蚓中SOD含量較高，且鑒于蚯蚓易于養殖、來源廣泛、生物安全性高的特點，其可以作為規模化生產SOD的原料。

實現發明目的的技術方案如下：一種超氧化物歧化酶的純化方法，包括以下步驟：

步驟一：取蚯蚓，使用清水對蚯蚓進行清洗，對蚯蚓進行吐泥處理，待蚯蚓吐泥完全后，取出，備用；

步驟二：將步驟一中的蚯蚓用組織搗碎勻漿機搗碎，經高速冷凍離心機離心分離，取離心液，即SOD提取液，備用；

步驟三：將SOD提取液進行不少于2次超濾，得到SOD純化液，備用；

步驟四：配置緩沖液，用緩沖液稀釋SOD純化液，配置濃度為2~100mg/ml的SOD溶液；

步驟五：使用Hampton公司的Index^TM和Crystal Screen的96種結晶試劑盒對步驟四中的SOD溶液進行結晶條件的篩選；

步驟六：將步驟五中結晶試劑盒內的結晶溶液體系放置在20℃的溫控箱中，結晶6~8天，收集結晶的蛋白質晶體，并冷凍保存。