[發明專利]一種脂肪酶突變體及其在制備(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的應用

有效

• 申請號: 202010036222.4
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111117983B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 王亞軍;班善赟;程峰;翁春躍;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州之江專利事務所(普通合伙) 33216
• 代理人: 牛世靜

本發明公開了一種脂肪酶突變體及其在制備(S)?2?氯苯甘氨酸甲酯中的應用，該脂肪酶突變體由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺突變為苯丙氨酸，第189位的異亮氨酸突變為賴氨酸，且第154位的纈氨酸突變為天冬氨酸而獲得。本發明通過分子對接和定點飽和突變，篩選獲得了可明顯縮短不對稱水解反應時間且對R型2?氯苯甘氨酸甲酯方拆分效率高、選擇性高的脂肪酶突變體，該突變體在反應12h后(S)?2?氯苯甘氨酸甲酯的得率達到了72.81％，ee值為95.24％，相對于野生型來說，實現了活性的提高和選擇性的反轉，同時縮短了反應時間。

技術領域

本發明涉及酶基因改造技術領域，具體涉及一種脂肪酶突變體及其在拆分(R,S)-2-氯苯甘氨酸甲酯制備單一對映體(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯中的應用。

背景技術

南極假絲酵母(Candida antarctica)是在南極洲分離得到的一種酵母菌，該菌株可以合成出CALA和CALB兩種不同的脂肪酶。早在1994年之前，人們就成功的分離出了這兩種脂肪酶，并對其氨基酸序列和三維結構進行了研究，發現南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)總共具有317個氨基酸，分子量為33kDa。

到目前為止，CALB被研究人員大量的在米曲霉、畢赤酵母、釀酒酵母和大腸桿菌中進行克隆表達，成為了商業上應用較為廣泛的一種酶。但是，野生型的CALB仍然具有一定的缺陷，如熱穩定性較差和產量較低等，對CALB進行修飾和改造使其具有更加良好的性質是較為熱門的一個研究。

2-氯苯甘氨酸甲酯(2-Chlorophenylglycine methyl ester)是一種具有生物活性的非天然的氨基酸酯，由2-苯甘氨酸與甲醇經酯化合成得到，其作為一種醫藥中間體，是目前合成高效抗血小板凝集類藥物氯吡格雷(Clopidogrel)的重要途徑之一。該藥物商品名為“波立維(Plavix)”，主要功能為抑制ADP誘導的血小板凝集，在血栓和心腦血管疾病治療上有著重要的作用。

氯吡格雷屬于手性類藥物，從臨床實驗研究結果中發現，(S)-氯吡格雷具有抗血小板凝集的活性，但(R)-氯吡格雷沒有顯示出相同的活性，并且有研究證明(S)-氯吡格雷的耐受性比(R)-氯吡格雷高約40倍。

對于手性藥物來說，手性與藥物的藥理活性、毒性和藥代動力學有著密切的關聯，高純度單一對映體具有治療靶點明確，療效更高、安全性更高等優勢。因此，作為合成氯吡格雷的重要原料，獲取單一對映體的2-氯苯甘氨酸甲酯對氯吡格雷的生產和使用有著重要的意義。

目前，外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯主要使用化學法進行拆分，主要使用的拆分劑為酒石酸和樟腦磺酸，向溶解于甲醇的外消旋鄰氯苯甘氨酸甲酯中加入等體積的拆分劑，隨后利用非對映體鹽拆分等方法進行拆分，其能獲得ee值達到99％以上的產物，產率在31％～45％，但其具有拆分劑添加量大、產廢量多、拆分成本高、反應時間長、原料浪費現象嚴重和操作過程繁瑣等缺陷。所以，開發一種高效、低成本且綠色環保的2-氯苯甘氨酸甲酯拆分方法是有著重要意義的。

生物催化制備醫藥中間體是近年來研究較為熱門的一個領域，相對于使用化學法獲取2-氯苯甘氨酸甲酯，使用酶催化方法表現得更加環保高效且低成本。目前的專利文獻對于利用酶直接拆分2-氯苯甘氨酸甲酯的研究報道還較少，2009年黃淳旭等人研究了使用堿性蛋白酶拆分鄰氯苯甘氨酸甲酯，在反應24h后得到了ee值達到99.8％的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯。2014年薛屏等人使用固定化青霉素G酰化酶拆分30h后得到了ee值為97.1％的產物，但還是存在反應時間長等缺陷。

野生型的南極假絲酵母脂肪酶B對2-氯苯甘氨酸甲酯幾乎沒有或僅有很低的對映選擇性，但是隨著對南極假絲酵母的氨基酸序列及晶體結構研究的深入，發現對CALB進行適當地修飾和改進可以提升CALB的選擇性，并大大加快反應進程，從而達到快速拆分2-氯苯甘氨酸甲酯的目的。

發明內容