[發明專利]副溶血弧菌的核酸快速恒溫檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010036130.6
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111020009B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 李園園;李雪玲;劉偉;韋朝春;賈犇;陸長德;李亦學;曹永梅
• 申請（專利權）人: 上海產業技術研究院;上海旺旺食品集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開了一種針對副溶血弧菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應用。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴增副溶血弧菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在副溶血弧菌。本發明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請號為201610780425.8、發明名稱為：“快速恒溫檢測副溶血弧菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請號為201510556917.4、發明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的優先權。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測副溶血弧菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽細菌，廣泛分布于江河、海洋及熱帶和溫帶沿海地區，主要寄生于浮游生物、魚、蝦蟹、貝類等水產品中，直接或間接食用被該菌污染的食品會引發腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應，嚴重者可引起敗血癥。副溶血弧菌發病呈世界性分布，尤其在沿海地區發病率較高，在我國沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒事件中所占比例已經超過沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌等，位居首位。因此，對于該菌的檢測和預防都具有重要意義。

目前，國內外針對副溶血弧菌的檢測方法仍以常規培養方法作為標準，其檢測周期較長(達5-7天)，操作相對復雜，檢測效率較低，難以滿足現代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來隨著核酸分子檢測技術的發展，以特異性基因為靶標建立的PCR技術已經成功應用于副溶血弧菌的檢測，具有靈敏度高，檢測時間短等優點，但該方法必須配備專門的儀器設備，并且需要專業的操作人員。因此，并不適合廣泛應用于基層檢測部門尤其是企業生產線內部進行的實時實地檢測。為確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的副溶血性弧菌。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun 15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。