[發明專利]蠟樣芽孢桿菌的核酸快速恒溫檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010036127.4
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111020045B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發明（設計）人: 劉偉;李園園;李雪玲;賈犇;韋朝春;陸長德;李亦學;曹永梅
• 申請（專利權）人: 上海產業技術研究院;上海旺旺食品集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/085
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種非診斷目的的針對蠟樣芽孢桿菌的快速恒溫檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從待測樣品中提取基因組DNA；

（2）以所述基因組DNA為模板，以能擴增蠟樣芽孢桿菌基因組特異性堿基序列的引物組作為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；

（3）通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在蠟樣芽孢桿菌；

其中，所述蠟樣芽孢桿菌基因組特異性堿基序列為GI號為218895141的蠟樣芽孢桿菌基因組的3193434～3194011 bp位序列；

其中，所述能擴增蠟樣芽孢桿菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物組B；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’- TAGAAAACGCGGGTATGA -3’；

下游外引物B3_B：5’- CCGGTTTAGATAATTCACGT -3’；

上游內引物FIP_B：5’- CTAGCGCCTTTGTATGTTCCTCGCAGAGGTTTTAGAAGTT -3’；

下游內引物BIP_B：5’- CCACAGAACACAAATGTAACTCATGGTTTCTCTCCCTTTCCTTTT -3’。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，所述酶反應體系包括：1× BstDNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP_B和BIP_B引物，0.15-0.3μmol/L的F3_B和B3_B引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜堿。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增反應的反應程序為：① 60～65℃孵育10～90min；② 80℃終止反應2～20min。

4.針對蠟樣芽孢桿菌的快速恒溫檢測的引物，其特征在于，所述引物包括能擴增蠟樣芽孢桿菌基因組特異性堿基序列的引物組，所述蠟樣芽孢桿菌基因組特異性堿基序列為GI號為218895141的蠟樣芽孢桿菌基因組的3193434～3194011 bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分；

其中，所述能擴增蠟樣芽孢桿菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物組B；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’- TAGAAAACGCGGGTATGA -3’；

下游外引物B3_B：5’- CCGGTTTAGATAATTCACGT -3’；

上游內引物FIP_B：5’- CTAGCGCCTTTGTATGTTCCTCGCAGAGGTTTTAGAAGTT -3’；

下游內引物BIP_B：5’- CCACAGAACACAAATGTAACTCATGGTTTCTCTCCCTTTCCTTTT -3’。

5.一種針對蠟樣芽孢桿菌的快速恒溫檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權利要求4所述的引物。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，其還包括Bst DNA聚合酶反應緩沖液、BstDNA聚合酶、dNTP 溶液、Mg²⁺、甜菜堿中的一種或多種。

7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的酶反應體系包括：1× BstDNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP_B和BIP_B引物，0.15-0.3μmol/L的F3_B和B3_B引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶，和0-1.5mol/L的甜菜堿。

8.引物在非診斷目的的恒溫檢測蠟樣芽孢桿菌中的應用，其特征在于，所述引物為如權利要求 4所述的引物。

9.如權利要求5~7之任一項所述的試劑盒在非診斷目的的恒溫檢測蠟樣芽孢桿菌中的應用。