[發明專利]一種快速鑒別柴胡屬種子的AS-PCR方法及應用

在審

• 申請號: 202010030499.6
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111073994A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 劉長利;戚文濤
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

1.一種鑒定柴胡種子真偽的方法，所述方法包括：從樣品種子中提取基因組DNA；以提取所得的基因組DNA為模板，并用柴胡特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測從而鑒定柴胡種子基原。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述柴胡特異性引物為：

BCF8：CAAGGAAACCGAAACTGAAC

BCR8：TATGGCAAGAGGTGCGTAACAA。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品種子是至少含有柴胡種子的樣品，比如可以是含有柴胡種子以及其它種類柴胡屬種子的混品，其它種類柴胡屬種子如可以是狹葉柴胡、窄竹葉柴胡、三島柴胡、小葉黑柴胡等。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述柴胡特異性引物進行PCR反應條件為：PCR反應所用的DNA聚合酶為EasyTaq酶，退火溫度為58℃，循環21次，DNA模板量2.0μl。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述PCR反應體系為：

所述PCR反應程序為：93℃預變性5min；93℃變性30s，58℃復性30s，72℃延伸30s，共計21循環；72℃延伸5min；4℃維持。

6.一種鑒定樣品種子中柴胡、狹葉柴胡、窄竹葉柴胡、三島柴胡或小葉黑柴胡的方法，所述方法包括：從樣品種子中提取基因組DNA；以提取所得的基因組DNA為模板，并分別用柴胡、狹葉柴胡、窄竹葉柴胡、三島柴胡或小葉黑柴胡的特異性性引物進行PCR擴增，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，從而鑒定種子樣品中柴胡、狹葉柴胡、窄竹葉柴胡、三島柴胡或小葉黑柴胡的基原。

7.根據權利要求6所述方法，其中各樣品種子的特異性引物分別為：所柴胡特異性引物為：

BCF8：CAAGGAAACCGAAACTGAAC

BCR8：TATGGCAAGAGGTGCGTAACAA；

狹葉柴胡特異性引物為：

BSF11：CGTCGGCCTCGGCCTGATGT

BSR11：ATGCCTTCCACCAATGTTGCGTTTT；

窄竹葉柴胡特異性引物為：

BMSF1：CGACATCCTTCTGATAAGTC

BMSR1：CGCAAGATGGCAAGAGGACA；

三島柴胡特異性引物為：

BFF7：CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGT

BFR7：GCTGCGGAGGGGCAAAGTTA；

小葉黑柴胡特異性引物為：

BMSF1：AAGGAAACCGAAACTGAACAGGA

BMSR1：GATGGCAAGAGGTGCGTAATATA。

8.根據權利要求6所述的方法，其中各種子樣品PCR反應體系和程序分別為：

所述柴胡特異性引物PCR反應體系為：

PCR反應程序為：93℃預變性5min；93℃變性30s，58℃復性30s，72℃延伸30s，共計21循環；72℃延伸5min；4℃維持；

狹葉柴胡特異性引物PCR反應體系為：

PCR反應程序為：93℃預變性5min；93℃變性30s，50℃復性30s，72℃延伸30s，共計22循環；72℃延伸5min；4℃維持；

窄竹葉柴胡特異性引物PCR反應體系為：

PCR反應程序為：95℃預變性3min；98℃變性20s，55℃復性30s，72℃延伸30s，共計25循環；72℃延伸7min；4℃維持；

三島柴胡特異性引物PCR反應體系為：

PCR反應程序為：93℃預變性5min；93℃變性30s，50℃復性30s，72℃延伸30s，共計21循環；72℃延伸5min；4℃維持；

小葉黑柴胡特異性引物PCR反應體系為：

PCR反應程序為：95℃預變性5min；98℃變性10s，55℃復性30s，72℃延伸45s，共計35循環；72℃延伸8min；4℃維持。