[發(fā)明專利]用于H7N9亞型禽流感病毒HA多肽競爭抑制ELISA抗體檢測的單克隆抗體及方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010029846.3
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111154728A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭大新;陳素娟;孫志豪;秦濤;劉秀梵
• 申請（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569;C07K16/10;C12R1/91
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

本發(fā)明屬于免疫領(lǐng)域，涉及一種用于H7N9亞型禽流感病毒HA多肽競爭抑制ELISA抗體檢測的單克隆抗體及方法。本發(fā)明公開了H7?12多肽抗體單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3G10(CCTCC No：C2019150)及其在H7N9亞型禽流感病毒HA多肽的競爭抑制ELISA抗體檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明利用篩選到的單抗3G10作為競爭抗體建立一種競爭抑制ELISA方法，用來檢測H7N9病毒感染血清抗體；因?yàn)镠7N9滅活標(biāo)記疫苗所產(chǎn)生的抗體中沒有針對H7?12的抗體，所以該方法又能作為標(biāo)記疫苗配套的檢測方法，用于區(qū)分臨床上H7N9亞型AIV野毒感染血清和標(biāo)記疫苗免疫血清，為H7N9亞型AIV的凈化提供了技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫領(lǐng)域，具體涉及一種基于H7N9亞型禽流感病毒HA多肽的競爭抑制ELISA抗體檢測方法。

背景技術(shù)

目前禽流感抗體檢測的常用方法主要包括血凝抑制(HI)試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。HI試驗(yàn)檢測對象為阻斷HA蛋白與受體結(jié)合的功能性抗體，而基于HA、NP、M或NS1蛋白的ELISA方法可以檢測所有目的蛋白的抗體，在保留不同蛋白特異性的同時(shí)具有更高的靈敏性、良好的重復(fù)性、高通量、高效率、操作方便快捷，而且價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，故大多數(shù)的DIVA疫苗均采用該技術(shù)作為配套的檢測方法。

H7N9亞型禽流感是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的疫病之一,并可引起人的感染和死亡,因此在公共衛(wèi)生上也具有重要意義。為了從源頭上消滅H7N9亞型禽流感，目前我國已開始在家禽使用H7N9亞型滅活疫苗并取得了良好的控制效果。為了評價(jià)H7N9亞型禽流感疫苗免疫的抗體水平，或未免疫禽群是否存在H7N9亞型禽流感病毒感染抗體，必須建立起H7N9亞型禽流感特異性抗體檢測方法。目前禽流感抗體的檢測方法很多,包括血凝抑制試驗(yàn)(HI),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID),免疫熒光試驗(yàn)和膠體金免疫層析技術(shù)，其中ELISA方法具有高靈敏性、良好的重復(fù)性、高通量、高效率、操作方便快捷的特點(diǎn)，在抗體檢測方面應(yīng)用廣泛。

而基于HA、NP、M或NS1蛋白的ELISA方法可以檢測所有目的蛋白的抗體，在保留不同蛋白特異性的同時(shí)，而且價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，故大多數(shù)的DIVA疫苗均采用該技術(shù)作為配套的檢測方法。

在前期工作中，我們研制的H7N9亞型AIV滅活標(biāo)記疫苗，其配套的檢測方法為多肽芯片檢測技術(shù)，雖然該方法有較好的靈敏度和特異性，但多肽芯片相對成本較高，且需要特定的儀器和設(shè)備，故不適合臨床上大量樣品的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種區(qū)分H7N9亞型AI野毒感染血清和標(biāo)記疫苗免疫血清的方法。是以H7-12肽制備單克隆抗體，經(jīng)生物學(xué)特性鑒定后篩選出可用于競爭抑制ELISA的單克隆抗體，利用該酶標(biāo)抗體建立競爭抑制ELISA，并進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，利用于臨床血清樣品的檢測，區(qū)分疫苗免疫的動物還是野毒株感染的動物，技術(shù)路線如圖1所示。

本發(fā)明公開了H7-12多肽抗體單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3G10，其保藏編號是CCTCCNo：C2019150。

本發(fā)明還公開了所述的H7-12多肽抗體單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3G10在H7N9亞型禽流感病毒HA多肽的競爭抑制ELISA抗體檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種基于H7N9亞型禽流感病毒HA多肽的競爭抑制ELISA抗體檢測方法，是以H7-12多肽抗體單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株3G10分泌的單克隆抗體為酶標(biāo)抗體，建立競爭抑制ELISA，進(jìn)行臨床血清樣品的檢測，區(qū)分疫苗免疫與野毒株感染的樣品。

本發(fā)明利用篩選到的單抗3G10作為競爭抗體建立一種競爭抑制ELISA方法，用來檢測H7N9病毒感染血清抗體；因?yàn)镠7N9滅活標(biāo)記疫苗所產(chǎn)生的抗體中沒有針對H7-12的抗體，所以該方法又能作為標(biāo)記疫苗配套的檢測方法，用于區(qū)分臨床上H7N9亞型AIV野毒感染血清和標(biāo)記疫苗免疫血清，為H7N9亞型AIV的凈化提供了技術(shù)支持。

附圖說明