[發明專利]豬GADD45a基因的新用途及高表達細胞系的構建和應用

有效

• 申請號: 202010028437.1
• 申請日: 2020-01-10
• 公開（公告）號: CN111206034B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 單體中;有文靜;汪以真
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

1.一種高表達豬GADD45a基因的細胞系的構建方法，其特征是：包括以下步驟：

1）、根據豬GADD45a基因全長序列和LentiORF^TM-pLEX-MCS載體，簡稱pLEX-MCS，設計并合成含有酶切位點的GADD45a全長的擴增引物；

2）從小豬脂肪組織中擴增得到GADD45a基因全長序列，回收并酶切，與酶切后的pLEX-MCS連接，構建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒質粒，單克隆測序鑒定并驗證后，采用脂質體轉染法將pLEX-MCS-GADD45a慢病毒質粒和pSPAX.2及pMD2.G共轉染到293T細胞中，獲得重組慢病毒；

3）采用步驟2）獲得的重組慢病毒轉染豬IPEC-J2細胞，獲得高表達豬GADD45a基因的IPEC-J2細胞系。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征是：所述步驟2）中構建pLEX-MCS-GADD45a慢病毒質粒的驗證：

取8×10⁵個/孔的密度接種于6孔細胞培養板中，然后用脂質體轉染pLEX-MCS-GADD45a質粒，48小時后提取蛋白，用Western blot 法檢測GADD45a和內參β-actin的表達。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征是：將步驟2）獲得的重組慢病毒進行鑒定：

將重組慢病毒轉染密度為70%~80%的293T細胞，48 h后用收集細胞，提取總蛋白并用Western blot 法檢測目的基因GADD45a和內參β-actin蛋白表達情況。