[發(fā)明專利]一種隱孢子蟲蛋白激酶660 C端蛋白的制備及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010027841.7
• 申請(qǐng)日: 2020-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN111154792A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮耀宇;張晨遠(yuǎn);李娜;肖立華;郭亞瓊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/54;C12N9/12
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

1.一種隱孢子蟲蛋白激酶660C端蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.以隱孢子蟲基因組DNA為模板，SEQ ID NO：1～2所示序列為擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到Cp660C基因片段；

S2.將S1所述將擴(kuò)增得到的Cp660C基因片段與原核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切，連接，得到Cp660C重組質(zhì)粒；

S3.將S2的Cp660C重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，挑取陽性克隆菌，保存；

S4.將S3挑取的陽性克隆菌擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD₆₀₀為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，16℃，180rpm，誘導(dǎo)12h；

S5.取S4誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，冷凍離心收集菌體，棄上清，清洗菌體后重懸，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制劑，冰浴超聲裂解菌體，得裂解液，再低溫離心取上清，并用0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾；

S6.取步驟S5中過濾后上清液經(jīng)Ni柱純化，洗脫，收集目的蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S1所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 5μL，5xPhusion HF buffer 10μL，ddH₂O 28.5μL，一共50μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S1所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5min；98℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸35s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S2所述原核表達(dá)質(zhì)粒為pET-28a質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S5具體為4℃離心收集菌體，8000rpm離心10min，棄上清；用25mL PBS清洗菌體，反復(fù)清洗3～5次；每100mL菌液加10mlPBS重懸菌體，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制劑；超聲裂解菌體，工作效率為45％，工作時(shí)長(zhǎng)2s，暫停時(shí)長(zhǎng)4s，共時(shí)長(zhǎng)40～60min，過程在冰浴中進(jìn)行；裂解后的菌液4℃離心，8000rpm，10min，收集上清，并用0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S6所述Ni柱在加入蛋白樣品前先加入5倍柱體積無離子水將填料中的20％乙醇洗滌干凈；再用5倍柱體積pH＝8.0結(jié)合緩沖液平衡Ni柱。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述洗脫為將蛋白樣品加入Ni柱中，使之與樹脂混合均勻，冰上孵育20min；將樣品反復(fù)上柱3次，樣品與Ni柱結(jié)合完全后，依次用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液、20mM咪唑溶液、40mM咪唑溶液、80mM咪唑溶液和100mM咪唑溶液進(jìn)行充分洗脫雜蛋白，最后用5倍柱體積的200mM咪唑溶液收集目的蛋白。

8.權(quán)利要求1～7任一所述的隱孢子蟲蛋白激酶660C端蛋白的制備方法在蛋白激酶660功能驗(yàn)證中的應(yīng)用。