[發明專利]D-木糖酸脫水酶及其應用

有效

• 申請號: 202010026812.9
• 申請日: 2020-01-10
• 公開（公告）號: CN111172143B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 陳可泉;麥丹丹;王昕
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種D?木糖酸脫水酶，所述D?木糖酸脫水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1～4所示，本發明通過易錯PCR對來自大腸桿菌的D?木糖酸脫水酶YjhG進行定向進化，得到四種D?木糖酸脫水酶YjhG基因序列，將其轉化大腸桿菌，獲得幾組活力較高的突變株91號、96號、62號和286號，這幾個菌株在12h內所消耗木糖酸分別為4.2g/L、4.8g/L、6.22g/L、5.43g/L，而出發菌株(親株A)在同等條件下消耗的木糖酸為2.15g/L，分別提高了2.1倍、2.4倍、2.89倍、2.5倍。

技術領域

本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種D-木糖酸脫水酶及其應用。

背景技術

D-木糖酸脫水酶，系統命名是D-木糖酸氫-裂解酶，能催化木糖酸脫水反應。目前木糖酸脫水酶有不同的菌株來源，比如嗜鹽的古細菌富鹽菌、新月丙桿菌和假單胞菌。不同來源的D-木糖酸脫水酶可以利用不同的底物，比如D-葡萄糖酸、D-木糖酸和D-木糖。雖然已知源自大腸桿菌的木糖酸脫水酶YjhG具有催化D-木糖酸脫水的酶學活性，但關于其性質的研究報道較少。

目前，已經可以確定D-木糖酸脫水酶是許多代謝途徑中的重要酶。在一些高附加值的化學品如乙二醇、三元醇和四元醇等生物合成途徑中，其中來源于大腸桿菌的木糖酸脫水酶YjhG被用來催化D-木糖酸脫水反應。例如在利用D-木糖通過生物途徑生產D-1,2,4-丁三醇的過程中，該合成途徑包括：(1)在D-木糖脫氫酶的催化下將D-木糖轉化為D-木糖酸；(2)D-木糖酸在D-木糖酸脫水酶的催化下生成D-3-脫氧甘油戊酮糖酸；(3)D-3-脫氧甘油戊酮糖酸在2-酮酸脫羧酶的催化下生成D-3,4-二羥基丁醛；(4)在脫氫酶催化下D-3,4-二羥基丁醛生成D-1,2,4-丁三醇。該酶對微生物發酵生產乙二醇、三元醇和四元醇的產量和質量有重要影響，但是，木糖酸脫水酶存在著反應速率緩慢，導致催化反應時間較長。因此，繼續篩選一種具有高催化效率的木糖酸脫水酶，以提高木糖酸脫水酶的反應速率。

發明內容

本發明要解決的技術問題是通過定向進化的技術手段提供一種具有高催化效率的木糖酸脫水酶YjhG。

本發明還要解決的技術問題是提供上述木糖酸脫水酶YjhG在制備多元醇中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

D-木糖酸脫水酶，所述D-木糖酸脫水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1～4所示。

編碼上述D-木糖酸脫水酶的基因序列在本發明的保護范圍之內，將SEQ ID NO.：1～4所示的核苷酸序列翻譯為基因序列即可得到本發明中所述的編碼D-木糖酸脫水酶的基因序列。

一種重組質粒，該重組質粒中包含上述編碼D-木糖酸脫水酶的基因序列。

一種重組細胞，該重組細胞中包含上述編碼D-木糖酸脫水酶的基因序列。

上述D-木糖酸脫水酶在制備多元醇中的應用在本發明的保護范圍之內。

作為優選，所述的多元醇為1,2,4-丁三醇。

一株產1,2,4-丁三醇的基因工程菌，在大腸桿菌中導入了本發明中的編碼D-木糖酸脫水酶的基因序列。

產1,2,4-丁三醇的基因工程菌，該大腸桿菌中導入了D-木糖酸脫水酶基因、D-木糖脫氫酶基因、苯甲酰甲酸脫羧酶基因、醇脫氫酶基因，所述的D-木糖脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示、苯甲酰甲酸脫羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：6所示、醇脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.：7所示。

上述產1,2,4-丁三醇的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：