[發明專利]一種白蟻胚胎發育研究方法

有效

• 申請號: 202010025361.7
• 申請日: 2020-01-10
• 公開（公告）號: CN111066736B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 張琪;孫儀林;王靖怡;顧俊文
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 張述學

1.一種白蟻胚胎發育研究方法，其特征是：包括不同發育階段的白蟻卵胚胎染色研究和白蟻卵人工孵化研究，包括以下步驟：

（1）收集白蟻卵

將工蟻、兵蟻、無翅繁殖蟻以10:1:1的比例養蟲室避光飼養，獲得無翅繁殖蟻產出的白蟻卵；

（2）白蟻卵前期處理

將白蟻卵清除白蟻卵表面的雜質和病原菌后進行離巢飼養，所述離巢飼養的具體方法為：在超凈工作臺中將清洗完畢的白蟻卵用滅過菌的刷子，掃至1.5%瓊脂糖平板配有200PPM四環素和200PPM多菌靈的培養基上，用封口膜封口，放入恒溫箱避光放置，獲得不同發育天數的白蟻卵，以用于不同發育階段的白蟻卵胚胎染色研究和白蟻卵人工孵化研究；

（3）不同發育階段的白蟻卵胚胎染色研究

a.卵殼的軟化

將發育天數為1-30天白蟻卵先放到-80攝氏度冰箱冷凍處理10min，分別進行軟化處理，處理時間和方法如下：

發育天數為1-7d的白蟻卵，加入30%次氯酸鈉溶液處理8min，靜止；

發育天數為8-15d的白蟻卵，加入50%次氯酸鈉溶液處理10min，靜止；

發育天數為16-22d的白蟻卵，加入70%次氯酸鈉溶液處理8min，靜止；

發育天數為23-30d的白蟻卵，加入80%次氯酸鈉溶液處理10min，靜止；

所述次氯酸鈉溶液加樣量為每25-35個白蟻卵樣品，加入2ml上述次氯酸鈉溶液；上述處理后均將次氯酸鈉溶液用移液槍吸出，將軟化處理后的白蟻卵用1×PBS潤洗3次，所述PBS為磷酸緩沖液Phosphate Buffered Saline，pH為7.4；

b.卵的固定

上述軟化處理后的白蟻卵，分別進行固定，所述白蟻卵固定方法如下：

上述不同發育天數的白蟻卵均加入10%多聚甲醛（Paraformaldehyde）溶液，每25-35個白蟻卵加入2ml的10%多聚甲醛溶液，室溫下200 rpm搖1h固定，后用移液槍吸出多聚甲醛溶液；

c.白蟻卵的染色

上述不同發育天數的白蟻卵固化處理后，隨即加入預先配好的染色液（DAPI：PBS =1:1000），每25-35個白蟻卵加入1ml染色液，用錫紙包好避光保存，置于室溫中染色16h，后將DAPI溶液用移液槍吸出，后加入1mlPBS（1×）清洗，每次靜置10min，重復三次；所述DAPI為4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)；

d.制片與保存

用移液槍將上述處理的白蟻卵與剩余溶液全部吸走至載玻片上，吸除PBS緩沖液后加入100μL 50%甘油（甘油：PBS=1：1）溶液，蓋上蓋玻片，觀察胚胎發育情況；

（4）白蟻卵人工孵化研究

將采集發育天數為27-29天的白蟻卵，放入設有無菌的濕潤原漿紙的培養皿中，配有潤濕的松木條，并放入同一種群工蟻，白蟻卵和工蟻的數量比為25:10，進行人工孵化。