[發明專利]一種人Legumain化學發光檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010023027.8
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111157725A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 李偉;趙樹杰
• 申請（專利權）人: 南京拂曉生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543
• 代理公司: 北京中建聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11004
• 代理人: 旦帥男;王靈靈

1.一種人Legumain化學發光檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分：

鏈霉親和素化磁珠懸浮液；

吖啶酯標記的Legumain抗體；

生物素標記Legumain抗體；

化學發光底物液，包括A液和B液，所述A液為硝酸溶液，B液為氫氧化鈉溶液；

校準品：濃度為0 pg/mL，10 pg/ mL、50 pg/mL、100 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL、2500 pg/mL的Legumain抗原；

質控品；

清洗液。

2. 如權利要求1所述的一種人Legumain化學發光檢測試劑盒，其特征在于，所述吖啶酯標記的Legumain抗體由以下步驟制備而成：將Legumain抗體放入離心管中室溫離心10s～30s，離心后加入碳酸緩沖液，混勻后加入吖啶酯溶液再次進行室室溫離心，離心后將離心管密封后放入避光暗盒中，然后將暗盒放入氣浴恒溫振蕩器中混勻，25℃震蕩混勻2 -4h，混勻后在離心管中加入封閉液，再次將暗盒放入氣浴恒溫振蕩器中混勻封閉，封閉時間1-2h，將封閉好的抗體上葡聚糖凝膠G250柱純化、用 PB緩沖液洗脫，收集，然后放入緩沖液中稀釋，保存吖啶酯標記的Legumain抗體備用。

3. 如權利要求2所述的一種人Legumain化學發光檢測試劑盒，其特征在于，所述吖啶酯標記的Legumain抗體中Legumain抗體的質量(μg)：吖啶酯溶液的體積(μl)為100﹕1，所述吖啶酯溶液濃度為2mg/mL，所述封閉液為20％的賴氨酸；所述緩沖液為50mM MES、0.05％吐溫-20和0.05％ Proclin300的混合液，pH = 6。

4.如權利要求1所述的一種人Legumain化學發光檢測試劑盒，其特征在于，所述鏈霉親和素化磁珠懸浮液由以下步驟制備而成：

1) 將氯化鐵和氯化亞鐵在水中溶解混勻后，加入氨水，在50-70℃下反應3-5h，得到磁性微球；

2) 將步驟1)得到的磁性微球分散于50％乙醇中，之后同0.5％ PEG4000、0.1％氨水和0.1％正硅酸乙酯在60-65℃攪拌反應 14h-18h，得到改性后的磁性微球；

3) 將步驟2) 得到的改性后的磁性微球用超純水和無水乙醇交替洗滌后重懸于 50％乙醇中，再分別加入0.05％氨水、0.5％四甲基氫氧化銨TMA和2.5％ 3－氨丙基三甲氧基硅烷，在室溫攪拌反應14h-18h，得表面修飾氨基的磁性微球；

4) 將步驟3) 得到表面修飾氨基的磁性微球用PBS緩沖液清洗并重懸再加入0.1％TMA、 2.5％戊二醛在室溫下攪拌反應30-40min，之后用碳酸緩沖液清洗并重懸超聲分散后按 20ug/mg磁性微球加入SA，37℃攪拌反應14h-18h，加入0.1％谷氨酸和1％BSA繼續反應1- 2h，反應后，利用含0.05％的Tween-20的PBS緩沖液洗滌3次后重懸于1％BSA中超聲分散即得SA磁性微球，加入磁微粒保存液于2～8℃保存，得到鏈霉親和素化磁珠得到鏈霉親和素化磁珠懸浮液備用。

5. 如權利要求1所述的一種人Legumain化學發光檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記Legumain抗體由以下步驟制備而成：利用 pH6.5的Tris緩沖液將Legumain抗體透析純化后，加入已活化的長鏈磺化生物素，2 - 8℃反應1-3h，再轉入室溫繼續反應10-30min，最后加入賴氨酸反應10 -30min，經純化，加入等體積甘油和0.1% NaN ₃或0.1%Proclin300，得到偶聯標記物標記的Legumain抗體。

6.如權利要求4所述的一種人Legumain化學發光檢測試劑盒，其特征在于，步驟1）中氯化鐵和氯化亞鐵摩爾比為2﹕1；步驟2）的PEG4000、氨水和正硅酸乙酯的體積比為1﹕5﹕1；步驟3）的氨水、四甲基氫氧化銨TMA和3-氨丙基三甲氧基硅烷的體積比為5﹕2﹕4；步驟4）中TMA、戊二醛、SA、谷氨酸、BSA的體積比為2﹕3﹕10﹕1﹕1。