[發明專利]棉花基因疊加目標系的建立及其應用

有效

• 申請號: 202010022938.9
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111197056B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 區永祥;李如玉;李亞梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/60
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

本發明公開了棉花起始目標系的獲得及其應用方法，含有attP、Lox重組位點的起始目標系通過目標載體轉化棉花下胚軸，分子分析及BLAST定位分析獲得了有利于目的基因疊加的4個棉花起始目標系的基因組位點。本發明公開的4個適合棉花基因定點疊加的基因組位點，有利于將相關功能基因通過位點特異性重組定點疊加在該基因位點處，不僅可以直接減少分離位點的數目，大大降低了將轉基因從實驗室品系滲入當地大田品種過程中的工作量，而且幾乎不影響其他基因的正常表達。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及棉花起始目標系的建立及其應用。

背景技術

現有技術中，轉基因一直通過傳統的育種方法導入商業品種。但不同品種間的雜交可導致許多重要的農藝性狀基因變成雜合狀態。對于育種來說，一個育種品系性狀必須要純合，不僅是轉基因性狀，也包括與大田優良品種相關的所有其他優良性狀。對于二倍體和類似二倍體的異源多倍體植物而言，在沒有遺傳連鎖的情況下，通過分離獲得n個獨立性狀的純合株系的比例是(1/4)ⁿ。例如，要獲得6個優良性狀和1個轉基因性狀的純合株系的概率為(1/4)⁷，但如果再添加3個轉基因位點，那么獲得純合株系的比例為(1/4)¹⁰，需要在超過1,000,000個單株中才有可能篩選到純合株系。自然地，回交越多，選出只占極少數比例的純合體就越耗時耗力。對于大量區域性品種的選育及其相應的田間試驗而言，增加分離的轉基因位點的數量促使轉基因作物改良的成本更高，時間更長。

為了保持單個轉基因位點，現有技術將新的基因和之前導入的基因體外結合重構進行新一輪轉化，再通過篩選單拷貝獲得植物株系。如果之前導入性狀較少，這種“重頭來做”的方式值得考慮。但當商業品種已有許多轉基因性狀時，每增加一個新的性狀，重新進行基因工程和重新釋放之前的性狀會變得更困難。

通常，避免多個分離位點的問題可通過直接轉化優良品種來解決。這可省去育種過程，也可加速新轉基因品種的開發。然而，多數商業品種的遺傳轉化更難轉化，需要大量的投入才能獲得足夠的可大田評估的獨立轉化事件。更麻煩的是從監管角度而言，即使是同樣的DNA的個體轉化，不同品種都被認為是不同事件，釋放評估要分別進行。而對一個整合事件滲入不同品種情況則被認為是同一個事件。

我們已經報道過一種在植物體內進行基因疊加的方法，該策略可以將一個新的基因定點整合在已有的轉基因位點之后(Hou et al.,2014)。該方法可以通過分支桿菌噬菌體Bxb1-att位點特異性整合酶系統將含轉基因的質粒定點整合到基因組重組位點，其中，Bxb1(整合酶)重組酶在不含其它蛋白質和高能輔助因子的作用下可以催化48bp的attP位點和38bp的attB位點發生重組，產生attL和attR位點(Ghosh et al.,2003)。Bxb1整合酶介導定點整合后不需要的DNA可以通過來源于大腸桿菌噬菌體P1中的Cre-lox重組系統刪除，其中Cre蛋白能夠使同向的34bp lox位點間發生重組。原則上，每個整合載體都會帶入新的重組位點(attP或attB)用于下一輪整合，因此該疊加系統可無限地進行下去。

為使該基因疊加系統可操作，首先必須要有一個目標植株系(起始系)，該目標系必須含有一個位點，由attP或attB序列組成，從而允許整合酶Bxb1催化位點特異性重組，實現目的基因的定點整合。

為使該基因疊加系統可操作，首先必須要有一個起始目標系。該目標系基因組中必須設置一個重組位點(attP或attB序列)(起始位點)，從而允許通過整合酶Bxb1催化此位點進行特異性重組，實現定點整合。同時，為了適宜于整合基因的表達和后續的育種，這個起始位點需要插入到基因組的適宜位置上：(1)報告基因gfp表達良好；(2)單拷貝；(3)非著絲粒近處；(4)沒有插入或靠近已知基因；(5)重組位點完整。在本工作中我們描述了適于秈稻的基因疊加系統的建立。

棉花是我國重要經濟作物，基因工程是遺傳改良的一個重要途徑。然而，其遺傳轉化是一瓶頸，周期長(平均1年獲得轉化苗)，效率低(平均～5％)。因此根據現有技術，本發明致力于建立一種適用于目的基因定點整合的棉花起始目標系。