[發(fā)明專利]一種A型肉毒毒素抑制劑及其制備方法與應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111153960B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴秋云;沈錦濤;余碩;劉佳;余云舟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C07K7/02
• 分類號: C07K7/02;A61K38/08;A61P39/02
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙靜

本發(fā)明公開了一類新型A型肉毒毒素輕鏈多肽類抑制劑及其制備方法與應(yīng)用。所述多肽類抑制劑的結(jié)構(gòu)式如式I所示。本發(fā)明通過Fmoc?固相肽合成法得到線性肽，然后酰胺化關(guān)環(huán)，純化后得到目標(biāo)物。各抑制劑對A型肉毒毒素輕鏈抑制IC₅₀處于0.37～3.1μM，能顯著延長A型肉毒毒素中毒小鼠的死亡時(shí)間。本發(fā)明對A型肉毒毒素的中毒治療具有應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種A型肉毒毒素抑制劑及其制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

肉毒毒素(Botulinum neurotoxins，BoNTs)是由革蘭氏陽性菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)分泌的外毒素，是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的生物毒素，被列為重要的生物戰(zhàn)劑之一。人類發(fā)現(xiàn)的肉毒毒素分為7種血清型(A～G)，其中A、B、E、F型可引起人群中毒，以A型毒性最強(qiáng)且最為常見。其結(jié)構(gòu)可分為重鏈與輕鏈。重鏈可與靶細(xì)胞膜表面特異性受體結(jié)合，介導(dǎo)輕鏈進(jìn)入靶細(xì)胞。輕鏈為其毒性成分，可特異性切割SNARE家族蛋白，阻止乙酰膽堿遞質(zhì)的釋放，阻斷了神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，引起肌肉麻痹(Duplantier AJ，et al.Curr Top in Chem 2016；16(21):2330-49)。

人類肉毒毒素中毒類型可分為四種(Atassi MZ，et al.Crit Rev Immunol 1999；19(3):219-60)：(1)食源性肉毒毒素中毒；(2)嬰兒肉毒毒素中毒；(3)吸入性中毒；(4)創(chuàng)傷性肉毒毒素中毒。目前食源性及嬰兒肉毒中毒事件仍時(shí)有發(fā)生。隨著A型肉毒毒素(BoNT/A)在醫(yī)療和美容的廣泛應(yīng)用，因使用不當(dāng)導(dǎo)致的肉毒中毒事件時(shí)有發(fā)生。

目前A型肉毒中毒采取馬抗進(jìn)行治療，然而馬抗存在過敏反應(yīng)、生產(chǎn)成本高以及低溫儲(chǔ)存等缺點(diǎn)，且抗毒素只能中和體液、血液中游離毒素，對細(xì)胞內(nèi)的毒素則無抑制效果。肉毒毒素往往在中毒數(shù)小時(shí)內(nèi)便可進(jìn)入神經(jīng)元，能在神經(jīng)元中存在數(shù)天甚至數(shù)月，持續(xù)性切割SNARE家族蛋白，阻斷乙酰膽堿遞質(zhì)的釋放。胞內(nèi)毒素只能通過人體自身降解被清除，使得病人的治療周期很長(Thanongsaksrikul J，et al.Toxins 2011；3(5):469-88)。因此，有必要開發(fā)小分子抑制劑用于A型肉毒中毒治療。

CPI-1(序列：Dab-(C)RWTKCL-NH₂)是目前已知的活性最強(qiáng)BoNT/A輕鏈多肽類抑制劑(K_i＝39.2±4.6nmol/L)，為含7個(gè)天然氨基酸與一個(gè)非天然氨基酸Dab(L-2,4-二氨基丁酸)的環(huán)肽(Adler M，et al.Bioorg Med Chem,2015,23(22):7264-73)。具有作用靶點(diǎn)專一，親和力較高，水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。然而CPI-1二硫鍵容易在體內(nèi)被還原而導(dǎo)致活性喪失。

發(fā)明內(nèi)容

為解決CPI-1易在體內(nèi)還原且抗酶解活性較差的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一類新型抑制劑，該類抑制劑比CPI-1的抗酶解能力更強(qiáng)，體外抑制BoNT/A輕鏈的活性比CPI-1稍低(見表1)，但體內(nèi)對BoNT/A的解毒顯著效果優(yōu)于CPI-1(見表2)。同時(shí)，對多肽進(jìn)行改造，在其C端引入疏水氨基酸或堿性氨基酸，進(jìn)一步提高了突變肽的抑制活性(見表1)。

本發(fā)明還提供了上述抑制劑在制備A型肉毒毒素解毒劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為通過設(shè)計(jì)一個(gè)包含胱硫醚或雙氨基的linker，對CPI-1序列中半胱氨酸的位置進(jìn)行替換，引入碳碳鍵或碳硫鍵替換二硫鍵作為骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步在多肽的C端引入疏水氨基酸及堿性氨基酸。

本發(fā)明所提供的新型環(huán)狀多肽抑制劑的序列通式如下：

Dab-RWTK-X-L-Z-NH₂

其中：Dab代表L-2,4-二氨基丁酸，R代表精氨酸，W代表色氨酸，T代表蘇氨酸，K代表賴氨酸，L代表亮氨酸；