[發明專利]一種利用玉米芯水解液中木糖一步發酵生產1,5-戊二胺的方法

有效

• 申請號: 202010021593.5
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111118077B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 陳可泉;李孟陽;王昕;黃勁松;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N15/70;C12N15/60;C12N15/53;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種利用玉米芯水解液中木糖一步發酵生產1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法為構建表達木糖脫氫酶xylb和賴氨酸脫羧酶CadA的基因工程菌，將基因工程菌制得的種子液按5％的體積比的接種量接種至含有玉米芯水解液的發酵培養基中發酵生產1,5-戊二胺；

其中，所述基因工程菌的構建方法包括如下步驟：

(1)構建重組質粒pCDFduet-CadA和重組質粒pTRC99a-xylb；

(2)構建大腸桿菌；

其中，含有玉米芯水解液的發酵培養基中各組分的濃度為2g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，10g/L硫酸銨，氯化鉀0.5g/L，硫酸鎂1.6g/L，硫酸亞鐵32mg/L，硫酸錳32mg/L，硫酸銅77mg/L，硫酸鋅86mg/L，維生素B₁60mg/L，煙酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸鈣10g/L；溶劑為玉米芯水解液；

其中，所述的發酵為37℃下發酵32～40h，發酵至10h時，向發酵培養基中加入IPTG至終濃度為1mmol/L。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組質粒pCDFduet-CadA的構建方法為將來源于大腸桿菌MG1655的賴氨酸脫羧酶的基因CadA，兩端設計酶切位點NotIII和BglII，亞克隆到載體pCDFduet上，獲得重組質粒pCDFduet-CadA。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組質粒pTRC99a-xylb的構建方法為將來源于Caulobacter crescentus的木糖脫氫酶的基因xylb，兩端設計酶切位點SacI和SalI，亞克隆到載體pTRC99a上，得到重組質粒pTRC99a-xylb。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，重組大腸桿菌的構建方法為將重組質粒pCDFduet-CadA和pTRC99a-xylb通過氯化鈣法轉化進入大腸桿菌表達宿主Ecoli.NT1003，得到表達木糖脫氫酶和賴氨酸脫羧酶的基因工程菌。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玉米芯水解液的制備方法為將玉米芯與稀硫酸混合后高溫滅菌，再加入Ca(OH)₂調節pH至7.0～7.5，第一次過濾，向第一濾液中加入活性炭，加熱，第二次過濾，所得第二濾液即為玉米芯水解液。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，稀硫酸的體積分數為0.5％～3％，玉米芯與稀硫酸的質量體積比為150～200g/L；所述的高溫滅菌為110～130℃滅菌15～30min；活性炭與第一濾液的質量體積比為10～20g/L；所述的加熱為40～60℃下加熱20～40min。