[發明專利]一種1型糖尿病疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 202010019317.5
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111035755B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 孫靜;胡云章;胡凝珠;李建芳;烏美妮;施建東;李彥涵;李志遠;馬春麗
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P3/10;C12N15/70;C12N15/66;C12N7/01;C12R1/92
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;于洪

本發明涉及一種1型糖尿病疫苗及其制備方法，屬于生物技術領域。本發明將GAD65的190?320位氨基酸序列及HSP60的437?460位的P277肽通過輔助性Th通用表位及間隔子序列插入T7噬菌體DNA衣殼蛋白10B編碼基因的3’端，使人GAD65的190?320位氨基酸序列及HSP60的437?460位的P277肽與T7?10B表達成融合蛋白，構建成為重組噬菌體GAD65_190?320+P277/T7，并進一步制備成疫苗。使用本發明疫苗免疫機體后，能誘導機體產生針對GAD65和277的特異性抗體，同時誘導機體產生免疫耐受，誘導產生Treg細胞，降低血糖，從而達到預防和治療1型糖尿病的目的。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種1型糖尿病疫苗及其制備方法。

背景技術

1型糖尿病(type?1diabetes?mellitus，T1DM)又稱為自身免疫性糖尿病，是由包括病毒感染、藥物接觸、遺傳因素及自身免疫在內的各種原因引起的由激活的T淋巴細胞介導的一系列自身免疫反應所引起的選擇性胰島β細胞破壞甚至功能衰竭，導致體內胰島素缺乏進行性加重以及慢性高血糖，依賴終身注射胰島素控制血糖。自1921年Best和Banting發現胰島素以來，皮下注射胰島素一直是治療T1DM的最主要手段。近年來隨著胰島素緩釋泵技術及基因工程改造的長效胰島素的廣泛應用，T1DM患者的血糖較以往得到了更有效的控制。但由于通過此類方法產生的胰島素釋放不受血糖調控，或者血糖釋放不符合生理節律等，患者的血糖往往波動較大，且容易引起低血糖暈厥。而且經濟成本高、具有潛在的副作用，給患者帶來了巨大的負擔。治療1型糖尿病的終極目標是抑制自身免疫性攻擊并避免全身性副作用，同時促進胰島再生和修復。但現有治療方法，無論胰島移植還是胰島素，都無法實現這一目的。因此使用免疫手段調控自身免疫系統引發免疫耐受可成為預防并治療1型糖尿病的創新手段。

GAD是谷氨酸代謝中γ-氨基丁酸的限速酶。谷氨酸脫羧酶(GAD65)是谷氨酸脫羧酶的異構體(65kD)由585個氨基酸殘基組成，是T1DM中一個重要的自身抗原，超過65％的T1DM患者在確診時體內有GAD65自身抗體。人體內出現GAD65抗體后有相當大一部分人最終會發展成T1DM。GAD65包含了許多不同的抗原表位，對自身免疫糖尿病的發生發展有著不同的影響，GAD_206-220、GAD_286-300、GAD_290-309、GAD_509-528、GAD_524-543、GAD_546-554抗原表位肽段或其特異性T細胞克隆能減輕自身免疫性胰島炎，降低發病率，是預防1型糖尿病的保護性表位。近年來，無論是在動物模型還是人類的研究中，應用GAD65肽、GAD65蛋白對T1DM進行預防和治療，均顯示GAD65可以成功地誘導機體的免疫耐受，降低T1DM的發病率。重塑機體免疫系統對自身抗原的特異性免疫耐受是治療1型糖尿病的最為理想的治療策略，而誘導抗原特異性Tregs是T1DM疫苗研究成功的關鍵。

人熱休克蛋白60(HSP60)是T1DM中胰島β細胞的自身抗原之一，P277肽是位于HSP60上437～460位的一段特異性多肽，在T1DM的發病機制中發揮重要作用。基于P277開發的融合蛋白疫苗在NOD模型鼠中也顯示了不錯的預防T1DM的效果。但是現有的P277多肽是由人工合成的，其成本高、產量低，限制了大規模藥效學的研究。同時研究也表明，患者需要長期持續的277治療才能達到效果，一旦停藥β細胞功能仍會繼續發生損傷，而且單獨免疫277誘導出的抗原特異性Treg細胞數量并不理想，這就使得P277必須通過其他的肽或表位聯合表達來增強其作用，同時在一個低成本、高產量、相對安全的疫苗載體上表達。

然而目前處于臨床研究的T1DM疫苗多為單抗原疫苗，而T1DM的自身抗體的表達水平不會一成不變，會受它們識別的抗原表位、自身抗原的水平、抗體表達的調控基因等多個因素的變化影響。50％～70％的T1DM在初診時可存在自身抗體陽性，隨著病程進展，陽性率會逐漸降低。因此，攜帶多個目標抗原或者是輔助抗原，拓寬疫苗的保護譜，是糖尿病疫苗優化設計的一種策略。