[發明專利]一種年老小鼠頦舌肌來源的成肌細胞的體外培養方法

有效

• 申請號: 202010018934.3
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111117953B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 朱露瑩;劉月華;盧燕勤;韓欣欣;於麗明;張維華;鄧佳佳
• 申請（專利權）人: 上海市口腔病防治院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙) 43213
• 代理人: 何湘玲

1.一種年老小鼠頦舌肌來源的成肌細胞的體外培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）剪取年老的小鼠頦舌肌，置于無菌PBS緩沖液中進行清洗，去除頦舌肌中的脂肪組織及血液，隨后放置于含有I型膠原酶的培養皿中，剪碎所述的頦舌肌組織，得到頦舌肌組織碎片和I型膠原酶的混合液；所述小鼠頦舌肌為12-16個月齡的老年C57BL/6小鼠頦舌肌；所述PBS緩沖液中含體積濃度為1%的PS，且使用前先于4℃條件下預冷；所述I型膠原酶的質量分數為0.05%-0.1%；

（2）收集所述步驟（1）得到的混合液置于離心管中，輕輕吹打混合均勻得到頦舌肌懸液，進行第一次消化，第一次消化期間每隔一段時間用吸管吹打使頦舌肌組織分散，離心去上清，吸去I型膠原酶后加入胰蛋白酶進行第二次消化，第二次消化期間每隔一段時間用吸管吹打使頦舌肌組織分散，終止消化；所述胰蛋白酶的質量分數為0.05%-0.25%，采用體積濃度為20%的FBS終止消化；

（3）將所述步驟（2）終止消化后得到的頦舌肌懸液進行離心，去上清液，得到的頦舌肌碎片用原代培養基進行重懸，輕輕吹打再混勻制成懸液，然后置于培養箱中采用差速貼壁培養法和半換液的方式進行培養，即得到所述的年老小鼠頦舌肌來源的成肌細胞；

所述原代培養基為含體積濃度為20%的FBS、體積濃度為1%的PS和體積濃度為0.6%的GlutaMAX的高糖型DMEM培養基；

采用差速貼壁培養法和半換液的方式進行培養的具體操作包括如下步驟：將所述懸液均勻轉移至6孔板中，搖勻后置于37℃、5%?CO₂的培養箱中貼壁培養0.5h后，吸取上清液轉移至6孔板的另一孔中繼續貼壁培養，每隔0.5h轉移一次，共轉移3-4次，3天后換傳代培養基，以后每隔2天半換一次傳代培養基，直到小鼠頦舌肌的成肌細胞增殖達到融合；所述傳代培養基為含體積濃度為10%的FBS、體積濃度為1%的PS和體積濃度為0.6%的GlutaMAX的高糖型DMEM培養基。

2.根據權利要求1所述的體外培養方法，其特征在于，所述小鼠頦舌肌由以下方法得到：用眼科剪剪開小鼠頦下皮膚，暴露二腹肌，用彎鑷分離二腹肌，用眼科剪剔除二腹肌后，暴露頦舌肌，用彎鎳分離出頦舌肌后，用眼科剪將其近遠心端離斷，即得到所述小鼠頦舌肌。

3.根據權利要求1所述的體外培養方法，其特征在于，所述步驟（1）中，將所述頦舌肌組織剪碎成0.5-1cm³大小的頦舌肌組織碎片。

4.根據權利要求1所述的體外培養方法，其特征在于，所述步驟（2）中，所述第一次消化的溫度為37℃，消化時間為30-40min，每隔10min用吸管吹打使組織分散，離心轉速為1000r/min，離心時間為10min。

5.根據權利要求1所述的體外培養方法，其特征在于，所述步驟（2）中，所述第二次消化的溫度為37℃，消化時間為30-40min，每隔10min用吸管吹打使組織分散。

6.根據權利要求1所述的體外培養方法，其特征在于，所述步驟（3）中，離心的轉速為1000rpm，離心時間為10min。