[發(fā)明專利]一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010018193.9
• 申請(qǐng)日: 2020-01-08
• 公開（公告）號(hào): CN111175518A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐東起;魏瑾;周揚(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州北角醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 杭州裕陽聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

1.一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：融合蛋白-抗原-抗體復(fù)合物，緩沖液，熒光素酶底物，標(biāo)準(zhǔn)品；所述抗體包括：GAD65抗體，IA-2a抗體，IA-2b抗體，IAA抗體，GADA抗體和ICA-512抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述融合蛋白-抗原-抗體復(fù)合物通過將熒光素酶基因與抗原基因融合成融合載體，然后利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，將融合載體導(dǎo)入哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中，進(jìn)行熒光素酶—抗原融合蛋白的表達(dá)；裂解基因重組細(xì)胞，獲得熒光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反應(yīng)，將熒光素酶-抗原融合蛋白稀釋液與樣本血清混合進(jìn)行特異性結(jié)合，獲得融合蛋白-抗原-抗體復(fù)合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包括：磷酸鹽吐溫緩沖液，磷酸鹽緩沖液，熒光素酶底物檢測(cè)緩沖液。

4.一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，構(gòu)建熒光素酶基因與抗原基因的融合載體，

選取熒光素酶基因和多抗原基因的目的序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在kpnl位點(diǎn)-GGTACC引入限制性內(nèi)切酶，獲得目的片段，做凝膠電泳進(jìn)行鑒定；所述多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；

將獲得的目的片段與載體質(zhì)粒分別進(jìn)行kpnl和xbal雙酶切，并使用T4連接酶將目的基因與載體基因連接得到重組質(zhì)粒；

步驟二，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與擴(kuò)繁提取，

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，進(jìn)行大腸桿菌菌種擴(kuò)繁，再使用質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒；

步驟三，獲取融合蛋白，

通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化將融合載體導(dǎo)入哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中，進(jìn)行熒光素酶—抗原融合蛋白的表達(dá)，裂解基因重組細(xì)胞，收集細(xì)胞，獲得熒光素酶-抗原融合蛋白；

步驟四，純化重組融合蛋白，

利用免疫沉淀反應(yīng)，將熒光素酶-抗原融合蛋白稀釋液與樣本血清混合進(jìn)行特異性結(jié)合，獲得融合蛋白-抗原-抗體復(fù)合物；

步驟五，使用蛋白A/G瓊脂糖酶標(biāo)板捕捉融合蛋白-抗原-抗體復(fù)合物，

步驟六，抗原抗體免疫反應(yīng)，

反應(yīng)體系包括：融合蛋白-抗原-抗體復(fù)合物，PBS緩沖液，PBST緩沖液，熒光素酶底物，標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品血清。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述載體質(zhì)粒為PA0815載體質(zhì)粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述熒光素酶基因?yàn)镽anilla熒光素酶基因。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述感受態(tài)大腸桿菌的菌種為基因工程轉(zhuǎn)化的含GAD65的重組大腸桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于Ⅰ型糖尿病聯(lián)合抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化將融合載體導(dǎo)入哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中的步驟包括：

1)將T293細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)40-60h，和細(xì)胞傳代培養(yǎng)40-60h；

2)使用重組質(zhì)粒進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)約48h后，使用PBS緩沖液收集細(xì)胞。