[發明專利]一種低豐度DNA突變測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 202010017509.2
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111074354A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 浦丹;舒坤賢;劉康雯;曹會勛
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6858
• 代理公司: 重慶輝騰律師事務所 50215
• 代理人: 王海軍

1.一種低豐度DNA突變測序文庫的構建方法，其特征在于，包括3'末端封閉的核苷酸單鏈與待測基因組雜交，所述3'末端封閉的核苷酸單鏈能與待測基因組中的野生型序列雜交形成完全互補配對的雙鏈DNA，與所述野生型序列的突變型序列雜交形成在突變位點處不能互補配對的雙鏈DNA；使用雙鏈特異性核酸酶消化所述完全互補配對的雙鏈DNA實現突變型DNA序列的富集；對富集的突變型DNA連接測序接頭；對連接測序接頭后的產物進行基于梯度關鍵變性溫度的PCR擴增，包括將所述連接測序接頭后的產物平均分成8份或11份平行反應，每份平行反應按不同的起始關鍵變性溫度變性，然后在起始關鍵變性溫度的基礎上按照步長0.2℃或者0.3℃升高變性，直至溫度梯度覆蓋范圍為2℃，獲得能成為高通量測序技術可用的DNA文庫。

2.如權利要求1所述的一種低豐度DNA突變測序文庫的構建方法，其特征在于，所述3'末端封閉的核苷酸單鏈的長度為19-26bp，T_m范圍為62-67℃；所述3'末端封閉的封閉方式為3'-ddNTP、3'-Pi或3'-NH2。

3.如權利要求1所述的一種低豐度DNA突變測序文庫的構建方法，其特征在于，所述雙鏈特異性核酸酶為一種熱穩定核酸酶，能夠特異性地消化完全互補的雙鏈DNA，對非完全互補DNA雙鏈的移除速率低于完全互補的DNA雙鏈的移除速率。

4.如權利要求1所述的一種低豐度DNA突變測序文庫的構建方法，其特征在于，所述測序接頭為Illumina或Ion Torrent平臺測序接頭。

5.如權利要求1所述的一種低豐度DNA突變測序文庫的構建方法，其特征在于，所述起始關鍵變性溫度設置為比引物T_m低2℃。