[發明專利]6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備阿米卡星檢測試劑中的用途

有效

• 申請號: 202010017376.9
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111537452B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 王貴利;張啟飛;李垚艷;龔俊;劉希
• 申請（專利權）人: 北京九強生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N35/00
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;程云

本申請涉及6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備阿米卡星檢測試劑中的用途。具體而言，本申請的6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體相較于野生型6?磷酸葡萄糖脫氫酶包含選自以下的一個突變或其組合：D306C、D375C、G426C。使用本申請的6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體所制備的檢測試劑盒，其特異性強、靈敏度高、操作方便、檢測時間短、定量準確，適合高通量檢測。

本申請要求2019年1月9日提交的201910017764.4和2019年5月21日提交的201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備檢測試劑中的用途》的優先權，其通過引用并入此處。

技術領域

本申請涉及生物檢測領域，特別是涉及一種突變的酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶(簡稱G6PDH)及其在阿米卡星檢測試劑盒中的應用。

背景技術

半抗原，某些小分子物質(分子量小于4000Da)，其單獨不能誘導免疫應答，即不具備免疫原性，但當其與大分子蛋白質或非抗原性的多聚賴氨酸等載體交聯或結合后可獲得免疫原性，誘導免疫應答。這些小分子物質可與應答效應產物結合，具備抗原性，它只有免疫反應性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。

半抗原能與對應抗體結合出現抗原-抗體反應，又不能單獨激發人或動物體產生抗體的抗原。它只有免疫反應性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。大多數多糖、類脂、激素、小分子藥物都屬于半抗原。如果用化學方法把半抗原與某種蛋白分子(載體)結合，會獲得新的免疫原性，并能刺激動物產生相應的抗體。半抗原一旦與蛋白結合，就構成該蛋白質的一個抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特異結構的化學活性基團物質(如青霉素、磺胺劑等)，稱為簡單半抗原。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，多采用競爭模式。原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，顯色愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

阿米卡星(Amikacin)結構式如下所示：

阿米卡星是氨基糖甙類抗生素，用于治療革蘭陰性桿菌所致的尿路、下呼吸道、腹腔、軟組織、骨和關節、生殖系統等部位的感染，以及敗血癥等。本品能引起不可逆性耳毒效應，腎毒性甚微，為可逆性，神經肌肉阻滯罕見。

因此，應對該藥不良反應監測予以重視。而且由于藥物代謝個體存在差異，臨床使用時應結合血藥濃度監測，制定合理的給藥方案，盡量避免不良反應發生。

目前已知的阿米卡星檢測方法主要有：高效液相色譜法(HPLC)、化學發光免疫、酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)、均相酶免疫測定法、膠乳凝集比濁法等方法。HPLC法需要復雜的樣品前處理，操作復雜周期長且成本昂貴；發光免疫法試劑成本昂貴，不適合常規治療藥物檢測，更不利于大范圍推廣。現有的均相酶免疫測定法、膠乳凝集比濁法常常因制備工藝復雜、批間差大，應用受到一定限制。

現有技術的方法依賴于對小分子藥物(阿米卡星)自身所帶反應基團進行的激活，之后再與酶進行反應。這樣的偶聯方法會出現同一葡萄糖六磷酸脫氫酶上鏈接有多個阿米卡星的情況，且偶聯位點難以確保一致性，難以保證小分子藥物和酶之間的定向1：1反應，而導致批間差異大。

發明內容

鑒于本領域的需求，本申請提供了一種新型的6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體、及其在制備阿米卡星檢測試劑盒中的用途。

根據一些實施方案，提供了一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體。區別于已有發表的專利US006090567A(Homogeneous?immunoassays?using?mutant?glucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脫氫酶的突變體，本申請的6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體，其包含選自以下的突變：D306C、G426C、D375C。