[發明專利]一種馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202010015249.5
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111004776A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 格日樂其木格;趙雅麗;張心壯;才文道力瑪;曹迪;納日嘎;芒來
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

1.一種馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于包括將馬肌肉塊滅菌、清除脂肪組織和結締組織后，粉碎成塊狀肌肉組織；

將所述塊狀肌肉組織經胰蛋白酶消化后，離心分離得到第一上清液和第一沉淀物；

將所述第一上清液離心，得到第二上清液和第二沉淀物，棄所述第二上清液，將所述第二沉淀物用增殖培養液重懸、離心后，得到第三上清液和第三沉淀物，棄所述第三上清液，將所述第三沉淀物增殖培養液懸浮，過細胞過濾器，收集第一濾液，將所述第一濾液離心后，得到第四沉淀物；

將所述第一沉淀物經過膠原酶消化處理后，過細胞過濾器，得到第二濾液，將所述第二濾液離心后，得到第四上清液和第五沉淀物，將所述第四上清液進一步離心得到第六沉淀物，將所述第五沉淀物和第六沉淀物混合后，用增殖培養液懸浮，離心后得到第五上清液和第七沉淀物；

將所述第四沉淀物懸浮液和和第七沉淀物懸浮液混合，離心，得到第六上清液和第八沉淀物；

所述第八沉淀物用增殖培養液懸浮，經細胞過濾器過濾后，得到第三濾液，將所述第三濾液離心，得到第九沉淀物馬骨骼肌衛星細胞；

將所述第九沉淀物用增殖培養液懸浮，培養，通過差速貼壁法純化得到純化的馬骨骼肌衛星細胞。

2.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述馬肌肉塊滅菌采用70％乙醇浸泡滅菌。

3.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述馬肌肉塊粉碎前，用含有青霉素鏈霉素的DPBS沖洗所述馬肌肉塊直至DPBS澄清無血色。

4.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述胰蛋白酶的質量分數為0.25％。

5.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述離心過程為700rpm-2000rpm，離心時間為5-15min。

6.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述第一濾液、第二濾液均采用70μm細胞過濾器，所述第三濾液采用40μm過濾器。

7.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述增殖培養液包括以下質量分數的原料：20％胎牛血清，1％青霉素鏈霉素和兩性霉素B以及余量的DMEM。

8.如權利要求1所述的馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，

所述膠原酶為Ⅳ型膠原酶，其通過DMEM稀釋濃度至1mg/1mL。