[發明專利]一種鑒定、分選、清除衰老細胞的方法和應用

有效

• 申請號: 202010014832.4
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111141904B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 紀俊峰;劉洋;陳祥寧
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/68;C12N5/071;C12N15/89
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發明公開了一種鑒定、分選、清除衰老細胞的方法和應用。利用免疫熒光、免疫組化或Western blot或定量PCR技術通過檢測細胞中的CLDN1鑒定衰老細胞；利用磁珠?抗體復合物或流式細胞術識別細胞中的CLDN1分選衰老活細胞；將CLDN1 shRNA或siRNA注射到衰老細胞的附近環境中或者衰老細胞內，注射后誘導衰老細胞發生細胞凋亡進而清除衰老細胞。本發明的衰老細胞殺傷手段非常新穎有效，通過基因沉默手段清除衰老細胞對抗衰老藥物靶點開發具有重要意義，填補了目前衰老細胞殺傷手段極為有限的空缺。

技術領域

本發明涉及了一種衰老細胞的處理方法，尤其是涉及了一種鑒定、分選、清除衰老細胞的方法和應用。

背景技術

細胞衰老是個體衰老和衰老相關疾病發生發展的重要誘因。而現階段常用的檢測衰老細胞的方法僅有SA-β-gal化學染色法，通過將體外的細胞固定殺死后，給予β-半乳糖苷酶的顯色底物X-gal進行化學染色，對于組織而言其特異性差，假陽性強，適用于體外培養的細胞，并且需要將活細胞殺死才可鑒定，因此也無法獲得能夠體外培養的活的衰老細胞，所以該方法的應用受到了一定的限制。目前還沒有一種能準確靈敏地鑒定和分選衰老活細胞的方法。

而衰老細胞的體內堆積會造成局部炎性環境和器官功能惡化，促進腫瘤和心血管疾病、糖尿病等代謝系統疾病、阿爾茲海默癥等神經退行性疾病、肝硬化、腎臟疾病、關節炎、皮膚老化等一系列衰老相關疾病的發生發展，而清除衰老細胞被證明可以減緩衰老相關疾病發生發展以及延長哺乳動物壽命。目前國外專利有使用一些臨床中使用的化療藥殺傷衰老細胞的例子，盡管有一定療效，但其特異性差、毒副作用高，所以該方法的應用受到了一定的限制。目前還沒有一種能安全穩定殺傷衰老細胞的手段。

發明內容

為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足，提供了一種利用CLDN1(Claudin1)抗體SEQ ID No.3和mRNA SEQ ID No.1-2表達對衰老活細胞鑒定的方法；以及抗體介導的衰老活細胞分選分離的方法；以及一種利用CLDN1(Claudin1)基因沉默SEQ ID No.5-9誘導衰老細胞發生細胞凋亡，進而清除衰老細胞的方法。

本發明解決上述問題所采用的技術方案包括以下步驟：

一、一種鑒定衰老細胞的方法：利用免疫熒光、免疫組化或Western blot或定量PCR技術通過檢測細胞中的CLDN1鑒定衰老細胞。

方法包括以下步驟：

1)取人/小鼠組織的石蠟切片、冰凍切片和細胞蛋白裂解液中的一種和如SEQ IDNo.3/SEQ ID No.4的CLDN1抗體共孵育，磷酸鹽緩沖液清洗2-3次；

2)用Western blot方法或免疫熒光或免疫組化成像檢測步驟1)中CLDN1的表達，若存在CLDN1蛋白的表達，則該細胞為衰老細胞。否則該細胞不為衰老細胞。

衰老細胞鑒定：組織石蠟切片、冰凍切片、原代分離的人或小鼠的細胞皆可通過CLDN1蛋白抗體進行免疫熒光、免疫印跡的方式對衰老細胞鑒定。亦可通過qPCR和測序的手段檢測如SEQ ID No.1/SEQ ID No.2的CLDN1 mRNA水平異常提高對衰老細胞鑒定。衰老的細胞會經受活性氧提高和DNA損傷，而CLDN1蛋白和mRNA的表達水平因此在衰老細胞中顯著上調，年輕細胞則CLDN1表達程度很低，進而實現快速鑒定，相比SA-β-gal對衰老細胞進行固定處死后化學染色，此方法更加快速靈敏，并且可實現活細胞水平鑒定。

二、一種分選衰老細胞的方法：利用磁珠-抗體復合物或流式細胞術識別細胞中的CLDN1分選衰老活細胞。

方法包括以下步驟：