[發(fā)明專利]牛微小隱孢子蟲特異性引物及其PCR檢測方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010014664.9
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111118189A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王鈺鑫;王一;許丹娜;宋軍科;趙光輝;李媛;董和平
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 西安新思維專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

1.一種牛微小隱孢子蟲特異性引物，其特征在于：所述的特異性引物序列如下：

上游引物CpF：5’-AGTGGTTACAGGTGGGATGAGT-3’；

下游引物CpR：5’-GCGAGTTTCCTTGATTCATAGC-3’。

2.如權(quán)利要求1所述的特異性引物在檢測牛微小隱孢子蟲中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性引物在檢測牛微小隱孢子蟲的普通PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)提取待測樣本的DNA獲得擴(kuò)增模板；

2)利用特異性引物對步驟1)獲得的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：10×exTaq buffer(Mg²⁺free)1.25μL，MgCl₂(25mM)0.6μL，dNTP(2.5mM)1μL，上下游引物(10mM)各0.5μL，ex Taq酶(5U/μL)0.07μL，模板DNA 1μL，ddH₂O補至12μL；反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃45s、56℃30s、72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min；

3)PCR產(chǎn)物的電泳檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)410bp左右的特異性條帶，則待測樣本中存在微小隱孢子蟲。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性引物檢測牛微小隱孢子蟲的納米PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)提取待測樣本的DNA獲得擴(kuò)增模板；

2)利用特異性引物對步驟1)獲得的DNA樣品進(jìn)行納米PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×Nano-QPCR buffer 6μL，上下游引物(10mM)各1μL，Taq enzyme mix(5U/μL)0.2μL，模板DNA1μL，ddH₂O補至12μL；反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃45s、56℃30s、72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min；

3)PCR產(chǎn)物的電泳檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)410bp左右的特異性條帶，則待測樣本中存在微小隱孢子蟲。

5.權(quán)利要求3或4所述的PCR檢測方法在鑒別、診斷和預(yù)防牛微小隱孢子蟲病中的應(yīng)用。