[發明專利]一種畢赤酵母的固定化方法及其應用

有效

• 申請號: 202010013832.2
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111073880B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 應漢杰;丁賽;陳勇;王芳娟;張德力;俞瑩;梁偲策
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N11/096
• 分類號: C12N11/096;C12N11/082;C12N11/089;C12N11/087;C12N11/093;C12N11/02;C12N9/16;C12R1/84
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種畢赤酵母的固定化方法及其應用，將經植物膠預處理后的纖維材料作為固定化載體，將畢赤酵母活化后接入固定化發酵培養基中培養，使菌株在培養的過程中吸附于載體上。此外，可將經過植物膠預處理后的纖維材料浸泡于甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨水溶液中進行二次預處理，再洗滌，干燥，即得。有益效果：本發明通過甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨處理，使載體表面帶有正電荷，將材料表面接入適當密度的正電荷可有效增強細胞表面粘附蛋白吸附，從而促進細胞粘附，同時不會對細胞活性產生消極影響，以提高產物的酶活，發酵罐產植酸酶，其酶活從12326.85U/mL提高到15221.85U/mL，且能縮短發酵總周期。

技術領域

本發明屬于工業生物技術領域，具體涉及一種畢赤酵母的固定化方法及其應用。

背景技術

植酸的化學名稱為肌醇六磷酸酯(myo-inositolhexakisdihydrogenph-oshate)，是植物種子中肌醇和磷酸的最主要存在形式，在谷物等食用作物種子中含量高1％～3％，占植物含磷總量的40％～70％。磷是在動物體內功能最多的無機營養素之一。在動物飼喂過程中，飼料中必須供給足夠的磷，才能維持禽畜的正常生命及生產活動，因此在飼養過程中必須要考慮飼料中磷添加量的問題。植酸酶是1907年由Suzuki等在玉米糠中發現的一種單體蛋白質，之后相繼在多種動物、植物及微生物中檢測到植酸酶的存在。植物來源的植酸酶最適pH范圍較窄，在單胃禽畜的胃腸環境中很難起作用，目前市場上所銷售的植酸酶多數來源于微生物。現今養殖業所用的谷物性飼料所占比例很大，谷物中磷的存在形式主要為植酸和植酸鹽，絕大多數單胃動物，如豬、雞的消化道內缺乏分解植酸的酶，對谷物性飼料中植酸的利用率很低，且不能被動物吸收的磷排放到環境中會對環境造成污染。同時，植酸易與二價或三價陽離子結合，形成不溶性鹽，阻礙動物小腸對礦物質元素的吸收，并且植酸會與蛋白質形成絡合物，影響蛋白質的吸收。在禽畜的基礎日糧中添加植酸酶，可以分解飼料中的植酸，提高動物對植酸的利用率，減少磷的排放，提高動物對礦物質元素和蛋白質的利用率。

巴斯德畢赤酵母作為甲醇營養型酵母，可通過基因改造后來表達外源蛋白，其中除了科研外還被用在工業生產當中，一年大概超過400種蛋白質已經被成功在畢赤酵母中表達，畢赤酵母作為良好的表達宿主主要有以下幾個重要的原因：1，商水平表達外源蛋白，無論在細胞內表達還是分泌到細胞外，蛋白質的含量很高而且易于純化；2，含有特有的強有為的AOX啟動子，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達；3，在基因的分子水平易于操作跟傳統的釀酒酵母所差無幾；4，遺傳穩定，外源基因能高拷貝整合到畢赤酵母基因組中；5，它可對外源蛋白進行高級的加工修飾例如糖基化，形成二硫鍵，不正確的蛋白可水解處理。但是，在工業生產中，由于甲醇誘導時間長的問題使得發酵周期延長很多，發酵液也很粘稠，最終不利用產物的分離，菌體也容易老化。

如今，固定化的技術得到很多的關注，技術也越發成熟，從而廣泛的應用于生物技術生產的各大領域。讓菌體與一些適合固定化發酵的材料接觸，菌體吸附在載體上，從而降低發酵液的濃度有利于營養物質的傳遞，此外，這些惰性的材料可以重復利用，即提高了發酵效率又有益于產物的分離，材料的重復利用，降低了生產成本的同時，也起到了環境保護的作用。

目前應用于畢赤酵母的固定方法常見的有包埋法和吸附法，但是國內仍然以包埋法為主。季更生等用3.0％的海藻酸鈉包埋活化48h的酵母培養液，在連續發酵35d的運行中從未發現染菌現象，不僅增加了酵母質量濃度加快發酵，而且使達到連續發酵“穩態”時間也縮短了，發酵操作相對穩定。

但是，包埋法所用到的凝膠顆粒機械性能很差，在攪拌發酵的時候很容易發生破碎，同時，包埋法仍然會對顆粒中心的菌體的氧氣和營養物質的傳遞造成阻礙，因此對畢赤酵母的生產效率有了一定的限制。為了更進一步提高植酸酶的生產效率，簡化生產工藝，降低生產成本，仍需要尋找更加天然、高效的固定化材料。