[發明專利]6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備甲氨喋呤檢測試劑中的用途

有效

• 申請號: 202010013644.X
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111487208B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 李微;張啟飛;金石;龔俊;劉希
• 申請（專利權）人: 北京九強生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N35/00
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;程云

本申請涉及6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備甲氨喋呤檢測試劑中的用途。具體而言，本申請的6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體相較于野生型6?磷酸葡萄糖脫氫酶包含選自以下的一個突變或其組合：D306C、D375C、G426C。使用本申請的6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體所制備的檢測試劑盒，其特異性強、靈敏度高、操作方便、檢測時間短、定量準確，適合高通量檢測。

本申請要求2019年1月9日提交的申請號為201910017764.4和2019年5月21日提交的申請號為201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備檢測試劑中的用途》的優先權，其通過引用并入此處。

技術領域

本申請涉及生物檢測領域，特別是涉及一種突變的酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶(簡稱G6PDH)及其在甲氨喋呤檢測試劑盒中的應用。

背景技術

半抗原，某些小分子物質(分子量小于4000Da)，其單獨不能誘導免疫應答，即不具備免疫原性，但當其與大分子蛋白質或非抗原性的多聚賴氨酸等載體交聯或結合后可獲得免疫原性，誘導免疫應答。這些小分子物質可與應答效應產物結合，具備抗原性，它只有免疫反應性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。

半抗原能與對應抗體結合出現抗原-抗體反應，又不能單獨激發人或動物體產生抗體的抗原。它只有免疫反應性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。大多數多糖、類脂、激素、小分子藥物都屬于半抗原。如果用化學方法把半抗原與某種蛋白分子(載體)結合，會獲得新的免疫原性，并能刺激動物產生相應的抗體。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，多采用競爭模式。原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，顯色愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

甲氨喋呤(Methotrexate)結構式如下所示：

甲氨喋呤又名氨甲基葉酸、甲氨蝶呤、氨甲喋呤，橙黃色結晶性粉末，熔點185至204℃，常溫下暴露于空氣中性質穩定，易溶于稀堿、酸或堿金屬的碳酸鹽溶液，微溶于稀鹽酸，幾乎不溶于水、乙醇、氯仿、乙醚。

甲氨喋呤為抗葉酸類抗腫瘤藥，主要通過對二氫葉酸還原酶的抑制而達到阻礙腫瘤細胞的合成，而抑制腫瘤細胞的生長與繁殖。主要功能全身用藥治療絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、各類急性白血病、乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、消化道癌、宮頸癌及惡性淋巴瘤等。用動脈插管灌注對頭頸部癌和肝癌也有較好療效，而甲氨蝶呤與阿達木單抗等生物制劑聯合用藥，可以更有效地緩解關節風濕病患者的疾病癥狀，減緩關節損傷的進展，并且可以改善身體功能。還可在異位妊娠局部胎囊注射緩解出血。

甲氨喋呤是白血病的主要治療藥在使用，但1951年Gubner等人提出有關將氨基喋呤用于慢性RA是有效的報告后，作為RA的治療藥而受到注意，并主要在歐美使用。甲氨喋呤是處方藥，必須由醫生開置，高劑量可引起骨質疏松、關節痛、眼刺激以及糖尿病，還可能引起卵細胞缺乏和精子減少，生育能力減退。和其他葉酸拮抗劑一樣，甲氨喋呤也有致畸作用，還可造成死胎。

基于上述原因，在治療過程中需及時進行甲氨喋呤血藥濃度監測，是輔助臨床治療、改善治療效果、降低毒性風險的有效方式。

目前已知的甲氨喋呤檢測方法主要有：高效液相色譜法(HPLC)、發光免疫、酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)等方法。高效液相色譜法可將藥物與代謝產物以及內源性物質分離，具有專一性強的特點，是檢測MTX血漿濃度的金標準，但該法需復雜的前處理過程和較長的測定時間，不適合大樣本的快速檢測。免疫法一定程度上會受到交叉反應的影響，但是其憑借快速、易操作的優點，已逐漸成為治療藥物監測的主要方法。發光免疫法試劑成本昂貴，不適合常規治療藥物檢測，不利于大范圍推廣。