[發明專利]6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備環孢霉素A檢測試劑中的用途

有效

• 申請號: 202010013174.7
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111678874B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 趙蕾;張啟飛;王貴利;龔俊;劉希
• 申請（專利權）人: 北京九強生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N35/00
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;程云

本申請涉及6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備環孢霉素A檢測試劑中的用途。具體而言，本申請的6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體相較于野生型6?磷酸葡萄糖脫氫酶包含選自以下的一個突變或其組合：D306C、D375C、G426C。使用本申請的6?磷酸葡萄糖脫氫酶突變體所制備的檢測試劑盒，其特異性強、靈敏度高、操作方便、檢測時間短、定量準確，適合高通量檢測。

本申請要求2019年1月9日提交的申請號為201910017764.4和2019年5月21日提交的申請號為201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脫氫酶突變體及其在制備檢測試劑中的用途》的優先權，其通過引用并入此處。

技術領域

本申請涉及生物檢測領域，特別是涉及一種突變的酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶(簡稱G6PDH)及其在環孢霉素A檢測試劑盒中的應用。

背景技術

半抗原，某些小分子物質(分子量小于4000Da)，其單獨不能誘導免疫應答，即不具備免疫原性，但當其與大分子蛋白質或非抗原性的多聚賴氨酸等載體交聯或結合后可獲得免疫原性，誘導免疫應答。這些小分子物質可與應答效應產物結合，具備抗原性，它只有免疫反應性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。

半抗原能與對應抗體結合出現抗原-抗體反應，又不能單獨激發人或動物體產生抗體的抗原。它只有免疫反應性，不具免疫原性，又稱不完全抗原。大多數多糖、類脂、激素、小分子藥物都屬于半抗原。如果用化學方法把半抗原與某種蛋白分子(載體)結合，會獲得新的免疫原性，并能刺激動物產生相應的抗體。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，多采用競爭模式。原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，顯色愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

環孢霉素A(Cyclosporine?A，CsA)結構式如下所示：

環孢霉素A是由真菌(多孢木霉菌或柱孢木霉菌)分泌的多種氨基酸組成的脂溶性環形肽。CsA作為具有高選擇性和超低骨髓毒性的免疫抑制劑，可選擇性抑制T輔助淋巴細胞的增殖和釋放，同時該藥物具有抗真菌活性，可有效降低患者感染情況。環孢霉素A在器官和組織移植、血液病和眼科疾病等方面具有重要臨床應用價值，在器官和組織移植方面，可預防同種異體腎、肝、心、骨髓等器官或組織移植所發生的排斥反應，也可預防及治療骨髓移植時發生的移植物抗宿主反應；在血液病方面，可應用于再生障礙性貧血、紅細胞再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、自身免疫性溶血性貧血等疾病；在眼科疾病方面，主要用于白塞氏綜合征、干眼癥、鞏膜炎、過敏性結膜炎等疾病。

環孢霉素A作為鈣調磷酸酶抑制劑常用藥物，已成為很多難治性腎病治療和器官移植的重要選擇之一，主要分布在除大腦外的人體組織中，在血液中主要分布在紅細胞和血漿中。環孢霉素A主要由肝臟代謝，已知代謝產物15種，消除半衰期10-27小時左右，代謝物主要由膽汁經糞便排泄，尿中僅0.1％以原藥形式排出。

然而，由于該藥物安全范圍窄、代謝影響因素復雜，在藥動學和藥效學上存在著明顯的個體差異，且血藥濃度與給藥量間相關性不佳，給臨床治療增加了難度，易產生腎毒性、多毛癥、牙齦增生等不良反應以及不良反應個體化差異嚴重等問題。

基于上述原因，在治療過程中需及時進行環孢霉素A血藥濃度監測，是輔助臨床治療、改善治療效果、降低毒性風險的有效方式。

目前已知的環孢霉素A檢測方法主要有：高效液相色譜法(HPLC)、發光免疫、酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)等方法。HPLC法需要復雜的樣品前處理，操作復雜周期長且成本昂貴；發光免疫法試劑成本昂貴，不適合常規治療藥物檢測，更不利于大范圍推廣。

現有的均相酶免疫測定法、膠乳凝集比濁法常常因制備工藝復雜、批間差大，應用受到一定限制。