[發明專利]PET降解生物催化劑及其應用

有效

• 申請號: 202010013024.6
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111100835B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 崔球;劉亞君;顏飛;韋韌
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12M1/40;C12M1/38;C12M1/02;C12M1/00;C08J11/10;C12R1/145;C08L67/02
• 代理公司: 山東康裕律師事務所 37311
• 代理人: 傅培

1.PET降解全菌催化劑，其特征在于：所述PET降解全菌催化劑由PET酶在耐熱菌株中表達得到；所述PET酶的序列如SEQ NO.1所示；所述耐熱菌株為熱纖梭菌（Clostridiumthermocellum）。

2.如權利要求1所述的PET降解全菌催化劑的構建方法，其特征在于：包括①質粒表達PET降解酶、②基因組表達PET降解酶和③表達PET降解小體；所述PET降解小體由帶組裝模塊的LCC和MHETase與帶粘連模塊的腳架蛋白通過蛋白質間的特異性相互作用實現胞外組裝得到。

3.根據權利要求2所述的PET降解全菌催化劑的構建方法，其特征在于：所述①質粒表達PET降解酶的具體步驟為：（1a）利用pHK質粒構建具有PET降解酶表達框的表達質粒pLCC；（1b）將表達質粒轉化到熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）中，得到轉化子；（1c）對轉化子中PET降解酶編碼基因進行PCR和測序驗證，并進行胞外蛋白的酶活測定，獲得質粒表達PET降解酶的全菌催化劑。

4.根據權利要求3所述的PET降解全菌催化劑的構建方法，其特征在于：所述步驟（1a）中的PET降解酶表達框是從5’端到3’端依次具有啟動子I、信號肽和PET降解酶編碼基因的序列；所述步驟具體為：利用分子克隆的方法將信號肽序列連接到PET降解酶編碼基因的5’端，然后連接到pHK質粒的啟動子I的3’端；所述pHK質粒是同時帶有大腸桿菌和梭菌的復制子的穿梭質粒，具有氯霉素和甲砜霉素抗性基因。

5.根據權利要求2所述的PET降解全菌催化劑的構建方法，其特征在于：所述②基因組表達PET降解酶的具體步驟為：（2a）將具有LCC和MHETase序列的融合表達框作為目標基因克隆到同源重組質粒pHK-HR中；（2b）選取16SrRNA基因序列為靶位點，采用無疤敲除及篩選方法，將融合表達框整合到熱纖梭菌基因組上，獲得基因組融合表達LCC和MHETase的菌株；（2c）通過胞外蛋白的酶活測定，確認PET降解酶是否成功表達，獲得基因組表達PET降解酶的全菌催化劑。

6.根據權利要求2所述的PET降解全菌催化劑的構建方法，其特征在于：所述③表達PET降解小體的具體步驟為：（3a）構建共轉錄表達LCC和MHETase的質粒pLa-Mf，LCC和MHETase分別融合來源于丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和黃色纖維梭菌（Clostridium clariflavum）的組裝模塊；（3b）將pLa-Mf中的共轉錄表達框作為目標基因克隆到同源重組質粒pHK-HR中，選取16SrRNA基因序列為靶位點，采用無疤敲除及篩選方法，整合到熱纖梭菌基因組上，分別獲得基因組共轉錄表達LCC和MHETase的菌株；（3c）利用啟動子II和信號肽構建表達降解小體腳架的質粒pSca，并將其轉化到所述的基因組共轉錄表達LCC和MHETase的菌株中；（3d）通過胞外蛋白的酶活測定，確認PET降解酶是否成功表達，從而獲得基于PET降解小體的全菌催化劑。

7.根據權利要求6所述的PET降解全菌催化劑的構建方法，其特征在于：步驟（3a）具體為：利用pHK質粒構建具有PET降解酶表達框的表達質粒pLCC；所述pLCC質粒的LCC編碼基因的3’端融合表達來自丙酮丁醇梭菌的組裝模塊DocCa，獲得質粒pLa；在質粒pLa中DocCa序列之后順序插入RBS序列、MHETase的編碼基因以及來自黃色纖維梭菌的組裝模塊DocCf的基因，獲得質粒pLa-Mf；步驟（3c）中構建質粒pSca具體為：按照啟動子II、信號肽、來自丙酮丁醇梭菌的粘連模塊、來自黃色纖維梭菌的粘連模塊的順序利用分子克隆的方式獲得融合序列，并克隆到質粒pHK中，獲得表達降解小體腳架的質粒pSca。